魏娉，路三軍，嚴金海，郭俊萍，姜琳娜

(1.邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002； 2.磁縣人民醫(yī)院，河北 邯鄲 056500)

?

·論 著·

Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系及其調(diào)控機制研究

魏娉1，路三軍1，嚴金海2，郭俊萍1，姜琳娜1

(1.邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002； 2.磁縣人民醫(yī)院，河北 邯鄲 056500)

目的:研究Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系及其調(diào)控機制。方法:分別將構(gòu)建好的pcDNA 3.1- Slug和miR- 140通過Lip 2000轉(zhuǎn)染到Eca- 109中，以pcDNA 3.1和Lip 2000空轉(zhuǎn)作為對照組，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細胞的形態(tài)變化，檢測細胞中E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達情況變化，另外使用穿透小室法檢測細胞的侵襲能力在轉(zhuǎn)染前后的變化情況。結(jié)果:轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1- Slug和miR- 140到Eca- 109中后細胞變得細長。轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1- Slug的Eca- 109中E- 鈣黏素表達下調(diào)，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達上調(diào)，細胞穿透基質(zhì)膠的數(shù)量明顯增多。轉(zhuǎn)染miR- 140的Eca- 109中E- 鈣黏素表達上調(diào)，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達下調(diào)，細胞穿透基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少。在食管癌細胞中miR- 140和Slug的表達呈負相關(guān)(r=-0.96)。結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子Slug能夠提高食管癌上皮細胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力和侵襲能力，而miR- 140是通過調(diào)控Slug來調(diào)節(jié)食管癌細胞侵襲性的。

Slug； 微小核糖核酸- 140； 食管癌； 侵襲能力； 上皮細胞- 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

在上皮細胞- 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生過程中，E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白等多種信號分子參與其中，在該過程中發(fā)揮著重要作用[1- 4]。Slug基因是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示，其在EMT的發(fā)生和發(fā)展過程中具有非常重要的作用，腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移與Slug基因的表達密切相關(guān)[5- 7]。另外研究顯示，miRNA在EMT中也具有非常重要的作用，例如miR- 200和miR- 205均已被證明能夠一直EMT，從而降低癌細胞的侵襲能力[8- 9]。然而miR- 140可能與Slug在食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中具有某種相互作用。本研究探討了二者在食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)聯(lián)，以期為后期食管癌轉(zhuǎn)移的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

Eca- 109人食管癌細胞株購自上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司,Slug cDNA的全長pcDNA 3.1載體由作者所在實驗室研究人員構(gòu)建完成,氯仿購自上海一基生物試劑有限公司,PCR試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司,Liposomes轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司,RPMI 1640購自Hyclone公司,相關(guān)引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 pc- DNA3.1- Slug載體構(gòu)建 設(shè)計Slug的引物序列為上游：5′- GCTCCTTCCTGGTCAAGAAACAT- 3′，下游：5′- CCGAGGTGAGGATCTCTGGTT- 3′。使用氯仿抽取Eca- 109細胞總RNA后反轉(zhuǎn)成cDNA，再使用Slug的引物擴增Slug DNA片段，然后構(gòu)建重組pcDNA 3.1- Slug質(zhì)粒并測序鑒定。測序鑒定無誤后使用Lip 2000將構(gòu)建好的重組pcDNA 3.1- Slug質(zhì)粒和miR- 140分別轉(zhuǎn)染至Eca- 109中，標(biāo)記為pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109組和miR- 140/Eca- 109組，另以Lip 2000轉(zhuǎn)染Eca- 109細胞和pcDNA 3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為對照組。

1.2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察 轉(zhuǎn)染48 h后在顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 免疫化學(xué)檢測細胞中E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達 將轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)48 h后漿細胞接種在涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，細胞貼壁后取出撥片，用之前已預(yù)冷的丙酮固定，PBS沖洗，加入對應(yīng)的1∶1 000稀釋過的一抗，30 min后PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，然后加入二抗，37 ℃ 30 min后PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，再加入三抗，30 min后PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，然后DBA顯色。計算E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白呈陽性的細胞數(shù)。

1.2.4 實時PCR檢測miR- 140和Slug的表達情況 引物設(shè)計：miR- 140莖環(huán)引物序列為：正義鏈5′- GGCAGAGAGTCCTAGCAGTC- 3′，反義鏈5′- AGTCAGATGACAGCCCCACA- 3′，Slug莖環(huán)引物序列為正義鏈5′- GCATTTCTTCACTCCGAAGC- 3′，反義鏈5′- TGAATTCCATGCTCTTGCAG- 3′。

表達量的計算公式為：相對表達量(R)=2-△△ct=

2-[(ct樣品- ct內(nèi)參)- (ct空白- ct內(nèi)參空白)]。

1.2.5 穿透小室法檢測細胞體外侵襲能力 將穿透小室置于24孔板內(nèi)，微孔膜嵌套上室鋪一層基質(zhì)膠，嵌套下室加入500μl事先配好的RPMI 1640(含有10%胎牛血清)，然后在嵌套上室中加入200 μl細胞懸液，每小組設(shè)置3復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后取出小室，去基質(zhì)膠后使用4%的多聚甲醛固定，HE染色后顯微鏡下觀察細胞并計數(shù)，穿膜的細胞數(shù)表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染前后細胞的形態(tài)變化

轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后在光鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化可知，pcDNA 3.1- Slug/ Eca- 109及miR- 140/Eca- 109組細胞與Lip 2000/Eca- 109組細胞及pcDNA 3.1/Eca- 109組細胞在形態(tài)學(xué)上的區(qū)別主要是pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109及miR- 140/Eca- 109轉(zhuǎn)染的細胞更細長，見圖1A、B、C。

A.未轉(zhuǎn)染； B.pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109轉(zhuǎn)染，細胞變得更細長； C.miR- 140/Eca- 109轉(zhuǎn)染

圖1 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后光鏡下觀察圖 ×400

2.2 體外驗證miR- 140對EMT轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用

免疫化學(xué)染色顯示，E- 鈣黏素主要位于Eca- 109細胞的胞漿和胞膜中，N- 鈣黏蛋白主要位于包膜中，波形蛋白主要位于胞漿中，呈顆粒狀。蛋白質(zhì)印跡法檢驗NC(non- specific control)、miR- 140模擬物、inhibitor加NC以及inhibitor轉(zhuǎn)染Eca- 109細胞后E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白、波形蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，miR- 140表達上調(diào)，相應(yīng)的E- 鈣黏素表達量上升，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達量下降。反之，在miR- 140表達受到抑制時，E- 鈣黏素表達量下降，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達量上升。據(jù)此可以推測miR- 140的表達可能調(diào)控E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達。見圖2、3。

GAPDH為甘油三磷酸脫氫酶

圖2 miR- 140表達對EMT標(biāo)志物表達影響的蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

圖3 miR- 140表達對EMT標(biāo)志物表達影響的積分光密度(IOD)檢測結(jié)果

2.3 miR- 140對Slug的調(diào)控作用

為檢測miR- 140對Slug的調(diào)控作用，使用免疫印跡法檢測miR- 140的表達量變化與Slug表達量之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR- 140的表達與Slug的表達呈負相關(guān)(r=-0.96)，該結(jié)果預(yù)示著miR- 140很有可能是通過作用于Slug基因來發(fā)揮調(diào)控作用的。見圖4～7。

2.4 miR- 140通過Slug發(fā)揮作用的驗證

為驗證miR- 140在Eca- 109細胞中對Slug的調(diào)控作用，通過RNA干擾的方法檢測miR- 140的表達與Slug表達的關(guān)系，結(jié)果顯示，Slug的表達水平在miR- 140抑制劑和siRNA/對照組共轉(zhuǎn)染細胞中均明顯降低。穿透小室侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-140抑制劑轉(zhuǎn)染沉默Slug的細胞后細胞的浸潤力發(fā)生了一定程度的逆轉(zhuǎn)。由此說明，miR- 140可能需要通過Slug發(fā)揮作用。見圖8、9。

圖4 定量實時檢測食管癌組織和對應(yīng)癌旁組織中Slug相對于GAPDH的表達水平

圖5 實時檢測NC組、miR- 140模擬物、抑制劑加NC和miR- 140抑制劑的Eca- 109細胞中Slug的mRNA表達水平

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測NC組、miR- 140模擬物、抑制劑加NC和miR- 140抑制劑的Eca- 109細胞中的Slug表達水平(以GAPDH作為對照)

圖7 miR- 140與Slug的mRNA在腫瘤樣本中表達量之間的關(guān)系

3 討 論

近年來食管癌在全球范圍內(nèi)的致死率已經(jīng)上升至第6位[10- 11]。臨床上主要采用手術(shù)并輔以放療和化療的治療方法，然而腫瘤易轉(zhuǎn)移而使患者的生存率始終保持在很低的水平[12]。闡明食管癌發(fā)生的機制對其預(yù)防和治療具有非常重要的意義。癌細胞的侵襲性主要是通過極性和黏附性來體現(xiàn)的，一旦有極性和黏附性的上皮細胞被轉(zhuǎn)化成具有侵襲性和移動性的間充質(zhì)細胞后癌細胞便變成了具有侵襲性的細胞[13]。EMT因在上皮細胞惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用而成為研究的熱點之一[14]。研究顯示，九成以上的惡性腫瘤均發(fā)生EMT而成為具有浸潤性的細胞而發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。Slug是轉(zhuǎn)錄因子Snail家族的一員，主要編碼一種鋅指蛋白，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，也是激活EMT過程中非常重要的轉(zhuǎn)錄因子之一[13]。其在EMT發(fā)生過程中主要有E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白等標(biāo)志物表達量的改變，主要是在具有浸潤性的細胞中E- 鈣黏素表達下調(diào)、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達上調(diào)。研究表明，miRNA在EMT的發(fā)生過程中也發(fā)揮著調(diào)控作用，通過RNA干擾機制來沉默腫瘤基因[16]。有研究顯示，miR- 140在EC細胞中的表達量下降，Slug的表達量在EC細胞中卻有所增加，但是其機制并未闡明。本研究旨在闡述Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系并闡明其調(diào)控機制。

本研究結(jié)果顯示，將pcDNA 3.1- Slug質(zhì)粒和miR- 140轉(zhuǎn)入Eca- 109細胞中構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株，同時以miR- 140的模擬物、miR- 140抑制劑等來調(diào)控miR- 140的表達量，以此來探討miR- 140的表達量和Slug表達量及其他標(biāo)志物表達量之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，沉默miR- 140導(dǎo)致E- 鈣黏素表達量的減少、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達量上升，能穿過基底膜的細胞數(shù)量明顯增加，顯示具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性的細胞數(shù)量明顯增多。而在miR- 140高表達的樣本中，由于miR- 140表達量的上升而導(dǎo)致E- 鈣黏素表達量上升，能穿過基底膜的細胞數(shù)量明顯減少，說明具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性的細胞數(shù)量明顯減少，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達量的下降，且miR- 140表達量和Slug的表達量呈負相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為-0.96。推測原因miR- 140對Slug的調(diào)控可能是與其3′- UTR結(jié)合而發(fā)揮作用，具體機制還有待進一步研究。

aP<0.05

A. 在Eca- 109細胞中Slug的相對表達量，可以看出抑制劑+siRNA/對照組和抑制制劑組的Slug相對表達量明顯高于抑制劑+siRNA/Slug組；B.不同組別中侵襲細胞數(shù)目，可以看出抑制劑+siRNA/對照組和抑制劑組侵襲細胞百分含量明顯高于抑制劑+siRNA/Slug組

圖8 Slug在miR- 140抑制劑和siRNA/對照組共轉(zhuǎn)染以及Slug沉默的細胞中的表達

圖9 穿透小室實驗檢測結(jié)果 ×100

綜上所述，在食管癌細胞中Slug高表達從而能誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，增強癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而miR- 140的過表達能夠增強Eca- 109細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，且miR- 140是通過靶向調(diào)控Slug的表達來影響食管癌的侵襲力和轉(zhuǎn)移的。

[1] 鄧超，王磊，丁浩然.E- 鈣黏素在膠質(zhì)瘤增殖與侵襲中的作用[J].腫瘤防治研究，2011，18(8):957- 959．

[2] 趙文文，丁愛萍，周泉，等.N- 鈣黏蛋白在胃癌組織中的表達[J].青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，21(3):164- 168．

[3] 李祖茂.人波形蛋白中間絲的結(jié)構(gòu)和功能及其與腫瘤的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)綜述，2009，24(17):2593- 2595．

[4] 馮迪，耿敬姝，于曉宇，等.Slug、E- cadherin、Vimentin及β- catenin在基底細胞樣乳腺癌中的表達[J].中國腫瘤，2013，23(9):757- 761．

[5] THAO A I，KARTHIKEYAN K，YEON W S，et al.Toxicity of nano molybdenum trioxide toward invasive breast cancer cells[J].Acs Appl Mater Inter，2014，6(4):2980- 2986．

[6] 錢江，陳旺盛，文坤明，等.Slug和E- cadherin在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義[J].中國老年學(xué)雜志，2012，24(13):2683- 2685．

[7] PARAS J，MUSHAL N，ROBERT G，et al.Over expression of Slug is associated with malignant progression of esophageal adenocarcinoma [J].World J Gastroenterol，2008，24(7):1044- 1052．

[8] 陶光利，張璟，卓文磊，等.RNA干擾抑制Slug表達在TGF- β1誘導(dǎo)的腎小管細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的抑制作用[J].免疫學(xué)雜志，2010，19(10):872- 875，882．

[9] TRAN M N，CHOI W，WSZOLEK M F，et al.The p63 protein isoform ΔNp63α inhibits epithelial- mesenchymal transition in human bladder cancer cells:Role of miR- 205[J].JBC，2013，288(5):3275- 3288．

[10] 王文憑，陳龍奇.食管癌外科治療的現(xiàn)狀與展望[J].中國胸心血管外科臨床雜志，2011，9(1):58- 65．

[11] 朱靜，陳小飛.食管癌分子靶向治療研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2011，39(5):623- 626.

[12] 赫捷，邵康.中國食管癌流行病學(xué)現(xiàn)狀、診療現(xiàn)狀及未來對策[J].中國癌癥雜志，2011，14(7):501- 504．

[13] 徐蕾，李旭，陳葳.轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug在人宮頸癌上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2012，9(6):778- 782．

[14] 洪倫，沈守榮.上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化及相關(guān)microRNA分子與腫瘤的惡性行為的研究進展[J].中國癌癥雜志，2011，21(9):725- 730．

[15] ADRIAN J M，GERALDINE G.Epithelial transition zones:merging microenvironments，niches，and cellular transformation[J].EJD，2011，21(2 Suppl):21- 28.

[16] 陶光利.Snail、Slug基因RNA干擾對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的作用[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2011．

Relationship between Slug and the invasion and metastasis of esophageal carcinoma and its regulation mechanism

WEI Ping1，LU San- jun1，YAN Jin- hai2，GUO Jun- ping1，JIANG Lin- na1

(1.The First Hospital of Handan City，Handan 056002，China； 2.The People’s HospitalofCixian，Handan056500，China)

Objective： To study the association of Slug with invasion and metastasis of esophageal carcinoma and its regulating mechanism. Methods: pcDNA 3.1- Slug recombinant plasmid was constructed and transfected into esophageal carcinoma cell lines of Eca- 109，with pcDNA 3.1 and Lip 2000 mock transfection served as control group. The morphological changes of cells were observed under the microscope. The expressions of E- cadherin， N- cadherin and vimentin were determined， and invasion ability of the cells before and after transfection was detected by Transwell chamber method. Results:The cells of miR- 140/Eca- 109 and pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109 became elongated. The expression of E- cadherin was down- regulated，and N- cadherin and waveform protein was increased in the Eca- 109 cells when transfected with pcDNA 3.1- Slug.The expression of E- cadherin was up- regulated， and N- cadherin and waveform protein was decreased in the Eca- 109 cells when transfected with miR- 140.The number of cells through the Matrigel was significantly reduced. The expression of miR- 140 and Slug in esophageal carcinoma cells was negatively correlated(r=-0.96). Conclusion: The Slug transcription factor can improve the ability of mesenchymal transition and invasion of esophageal epithelial cells， and miR- 140 may regulate the cell invasion of Eca- 109 via controlling Slug expression．

Slug; miR- 140; esophageal cancer; invasion ability; epithelial- mesenchymal transition

2016- 02- 01

2016- 03- 20

魏娉(1974-)，女，河北邯鄲人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。E- mail:2049167585@qq.com

魏娉，路三軍，嚴金海，等.Slug與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系及其調(diào)控機制研究[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，35(4)：569- 574．

R735.1

A

1671- 6264(2016)04- 0569- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.022