紀(jì)勇，胡斌，朱乾坤，朱幸楓，徐震壯，吳小波

(南京醫(yī)科大學(xué) 附屬無錫市人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214023)

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·論 著·

二型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)因子在食管癌患者外周血中的表達(dá)情況分析

紀(jì)勇，胡斌，朱乾坤，朱幸楓，徐震壯，吳小波

(南京醫(yī)科大學(xué) 附屬無錫市人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214023)

目的：探討二型固有淋巴細(xì)胞(ILC2s)在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：熒光定量PCR技術(shù)檢測我院手術(shù)治療的食管癌患者及健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中GATA3、RORα、T1/ST2及IL- 33 mRNA的表達(dá)量；ELISA技術(shù)檢測血漿中IL- 33含量。結(jié)果：食管癌患者PBMC中ILC2s相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄因子GATA3和RORα、表面膜受體T1/ST2及活化分子IL- 33的mRNA水平都比健康人高，并且患者血漿IL- 33含量明顯升高(P<0.05)。結(jié)論：食管癌患者ILC2s效應(yīng)增強(qiáng)，可能通過效應(yīng)分子的分泌及介導(dǎo)Th2細(xì)胞的極化而在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

二型固有淋巴細(xì)胞； Th2細(xì)胞； 食管癌

食管癌是目前全球發(fā)病率較高的惡性腫瘤，并且預(yù)后差、死亡率高。高復(fù)發(fā)率和易轉(zhuǎn)移是食管癌預(yù)后不良的主要原因之一。隨著腫瘤免疫學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)存在多種免疫抑制性細(xì)胞，這些細(xì)胞及其分泌的相關(guān)因子抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，構(gòu)成一個(gè)免疫抑制性的環(huán)境，利于腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫應(yīng)答，是阻礙腫瘤治療成功的一大障礙。食管癌患者Th1與Th2比例失衡是腫瘤逃避機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要原因之一[1]。二型固有淋巴細(xì)胞(group 2 innate lymphoid cells， ILC2s)在Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中扮演重要作用[2]。本研究通過檢測ILC2s特異性轉(zhuǎn)錄因子、相關(guān)細(xì)胞因子及膜表面細(xì)胞因子受體，分析ILC2s在食管癌患者外周血中的情況，探討ILC2s在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集我院2012年11月至2014年2月新確診的食管癌患者42例，其中男30例，女12例，年齡34～68歲，平均57.4歲。所有患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查均符合食管癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且外周血液標(biāo)本收集時(shí)患者均未經(jīng)臨床處理。30名健康體檢者標(biāo)本作為對(duì)照，其中男20例，女10例，年齡35～74歲，平均58.4歲，既往有過敏病史或合并慢性支氣管炎、高血壓、糖尿病患者予以排除。兩組研究對(duì)象性別、年齡、病情等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受檢者都簽訂知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集 收集外周血標(biāo)本后分離出血漿并置于-80 ℃保存，F(xiàn)icoll分離液(上海博升生物科技有限公司)分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并加入1 ml Trizol(Invitrogen公司)，-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2.2 RNA提取及定量PCR 用異硫氰酸胍/苯酚法人總RNA提取試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)提取PBMC總RNA；取500 ng RNA，使用Prime Script RT Reagent Kit Perfect Real Time試劑盒 (TaKaRa公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；以GenBank為基礎(chǔ)，使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，由上海Invitrogen公司合成；使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)進(jìn)行熒光定量PCR。各目的基因相對(duì)β- 肌動(dòng)蛋白表達(dá)的倍數(shù)變化用基于閾值循環(huán)數(shù)(Ct)的方式計(jì)算。所有樣本分別獨(dú)立檢測3次。

表1 定量PCR各引物序列

Tab 1 Quantitative PCR sequences for each primers

基 因引 物GATA3上游：5′?TTGTGGTGGTCTGACAGTTC?3′下游：5′?AGTACAGCTCCGGACTCTTC?3′RORα上游：5′?CTGACGAGGACAGGAGTAGG?3′下游：5′?GTGCGCAGACAGAGCTATTC?3′T1/ST2上游：5′?AGATGAGTCACTGGCATACG?3′下游：5′?GAGAGGCTGGCTGTTGTATT?3′IL?33上游：5′?TGACGGTGTTGATGGTAAGATG?3′下游：5′?ACAGAGTGTTCCTTGTTGTTGG?3′β?肌動(dòng)蛋白上游：5′?TGGCACCCAGCACAATGAA?3′下游：5′?CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA?3′

1.2.3 ELISA方法檢測血漿細(xì)胞因子 血漿IL- 33水平用ELISA試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)檢測，各樣品均重復(fù)檢測3次，求平均濃度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算血漿含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 食管癌患者PBMC中RORα和GATA3表達(dá)升高

RORα和GATA3是ILC2s形成和發(fā)揮功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，定量PCR分析食管癌患者及健康對(duì)照者PBMC中RORα和GATA3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，食管癌患者PBMC中RORα和GATA3表達(dá)水平較健康對(duì)照者明顯升高(圖1)。

a與對(duì)照比較，P<0.05

圖1 PBMC中RORα mRNA和GATA3 mRNA表達(dá)水平的比較

Fig 1 The expression level of RORα mRNA and GATA3 mRNA in PBMC

2.2 食管癌患者PBMC中ILC2s表面分子T1/ST2 mRNA的表達(dá)升高

T1/ST2是ILC2s表面相對(duì)特異性的受體分子，比較食管癌患者和健康對(duì)照者T1/ST2的PBMC中T1/ST2 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，食管癌患者T1/ST2 mRNA的表達(dá)明顯升高(圖2)。

2.3 食管癌患者PBMC中IL- 33 mRNA水平增高并且血漿中IL- 33含量增加

IL- 33能夠誘導(dǎo)ILCs和Th2細(xì)胞的極化，通過定量PCR檢測PBMC中IL- 33 mRNA水平，用ELISA方法檢測血漿IL- 33含量，結(jié)果顯示，食管癌患者PBMC中IL- 33 mRNA水平明顯增高，血漿中IL- 33含量明顯增多(圖3)。

a 與對(duì)照比較，P<0.05

圖2 TT1/ST2的變化

Fig 2 The expression level change of TT1/ST2

a 與對(duì)照比較，P<0.05； b 與對(duì)照比較,P<0.05

圖3 IL- 33在PBMC和血漿中表達(dá)水平的比較

Fig 3 The level of IL- 33 mRNA in PBMC and the level of IL- 33 in plasma

3 討 論

ILC2s是最近才被認(rèn)識(shí)的一群細(xì)胞，又稱為nuocytes、固有輔助細(xì)胞或者天然輔助細(xì)胞，可以被IL- 25和(或)IL- 33活化。ILC2s高表達(dá)T1/ST2、IL- 17BR、IL- 7Rα、ICOS和CD45。ILC2s分泌的IL- 13和IL- 5能誘導(dǎo)機(jī)體早期的Th2型免疫應(yīng)答，在機(jī)體抗寄生蟲感染及氣道炎癥反應(yīng)方面具有重要作用[3- 4]。而且文獻(xiàn)報(bào)道顯示ILC2s能抑制過敏性哮喘相關(guān)的氣道高反應(yīng)性[5]。除此之外，ILC2s對(duì)急性流感病毒感染所致的氣道組織損傷具有修復(fù)作用[6]。已經(jīng)證實(shí)CD4+Th1細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)是機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤免疫力的主要細(xì)胞群，然而免疫反應(yīng)偏離Th2型應(yīng)答時(shí)，Th1細(xì)胞反應(yīng)將受到抑制[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，該ILC2s是肺部精氨酸酶1(Arg1)的重要來源之一，并且IL- 33通過增加ILC2s和巨噬細(xì)胞的數(shù)量從而活化Arg1[8]。腫瘤發(fā)生時(shí)，Arg1通過多種效應(yīng)抑制T細(xì)胞的作用，使腫瘤逃避機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

本研究中我們分析了食管癌患者PBMC中ILC2s相關(guān)因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，食管癌患者PBMC中轉(zhuǎn)錄因子RORα和GATA3、膜表面受體T1/ST2及二型細(xì)胞因子IL- 33的mRNA水平都增高，并且血漿中IL- 33水平也明顯增高。這些說明食管癌發(fā)生時(shí)，ILC2s效應(yīng)增強(qiáng)，并且可能通過介導(dǎo)機(jī)體偏向Th2免疫應(yīng)答的方式促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸，從而利于食管癌發(fā)生發(fā)展。但I(xiàn)LC2s介導(dǎo)Th2型應(yīng)答的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

總之，通過特異性轉(zhuǎn)錄因子、受體和相關(guān)的細(xì)胞因子的檢測，我們發(fā)現(xiàn)，食管癌患者ILC2s增多，這可能參與Th1/Th2細(xì)胞的不平衡，從而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，但I(xiàn)LC2s在食管癌中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

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Analysis of the expression of ILC2s associated moleculars in peripheral blood mononuclear cells of esophageal cancer patients

JI Yong，HU Bin，ZHU Qian- kun，ZHU Xin- feng，XU Zhen- zhuang，WU Xiao- bo

(Wuxi People，s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi 214023，China)

Objective: To investigate the role of group 2 innate lymphoid cells(ILC2s) in the genesis and development of esophageal cancer. Methods: Quantitative PCR was used to examine the expression of GATA3，RORα，T1/ST2 and IL- 33 mRNA of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)， and ELISA was used to detect the level of IL- 33 in the plasma of esophageal cancer patients and healthy controls. Results: The expression of GATA3，RORα，T1/ST2 and IL- 33 mRNA of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) and the level of IL- 33 in the plasma of esophageal cancer patients were higher than those of healthy controls(P<0.05). Conclusion: The effects associated with ILC2s of esophageal cancer patients are increased， and ILC2s may play an important role in the genesis and development of esophageal cancer by the secretion of effector moleculars and mediating the polarization of Th2 cells．

group 2 innate lymphoid cells； T helper 2 cells； esophageal cancer

2016- 03- 30

2016- 04- 16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H81402004)；無錫市科技局指導(dǎo)性項(xiàng)目(CSZ00N1205)

紀(jì)勇(1981-)，男，江蘇東海人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。E- mail:1545113644@qq.com

吳小波 E- mail:wuxb@wuxiph.com

紀(jì)勇，胡斌，朱乾坤，等.二型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)因子在食管癌患者外周血中的表達(dá)情況分析[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，35(4)：502- 505．

R735.1

A

1671- 6264(2016)04- 0502- 04

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.006