陳海燕，冷曉紅，郭鴻雁，李 軍，郝彩琴

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021

RP-HPLC法測(cè)定苦豆子總堿中苦參堿與氧化苦參堿、槐果堿與氧化槐果堿含量*

陳海燕，冷曉紅，郭鴻雁，李 軍，郝彩琴

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021

目的:建立測(cè)定苦豆子總堿中氧化型生物堿與還原型生物堿含量的反相高效液相色譜法。 方法:采用C18鍵合硅膠反相柱，以乙腈-0.05 m ol/L磷酸二氫鉀水溶液(三乙胺2.0 m L/L)為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，柱溫30℃，流速1.0 m L/m i n。結(jié)果:氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿分離良好，氧化苦參堿平均回收率為99.10%，RSD為1.15%；苦參堿平均回收率為98.76%，RSD為1.64%；氧化槐果堿平均回收率為100.12%，RSD為1.86%；槐果堿平均回收率為98.35%，RSD為2.01%。結(jié)論:所建立的測(cè)定苦豆子總堿中氧化型與還原型生物堿含量方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，能有效控制苦豆子總堿質(zhì)量。

反相高效液相色譜法；苦豆子總堿；氧化苦參堿；氧化槐果堿；苦參堿；槐果堿；含量測(cè)定

苦豆子Sophora aLopecuroides L.為豆科槐屬多年生草本植物，生物體內(nèi)含有20多種生物堿類成分［1］，藥用部位主要為干燥地上部分及種子，性寒有毒、味極苦?？喽棺涌倝A(Total alkali Sophora alopecuroids L.，TASa)是從苦豆子的干燥全草和種子中提取的總生物堿，主要含有槐胺堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，苦豆子總堿具有抗腫瘤、抗菌、抗炎以及清熱解毒、祛風(fēng)燥濕作用［2-5］。以苦豆子總生物堿為原料生產(chǎn)的克瀉靈片是治療急、慢性腸炎、結(jié)腸炎的理想藥品，為國(guó)家中藥保護(hù)品種。此外在治療婦科炎癥、慢性乙型病毒性肝炎等方面苦豆子總堿也具有明顯療效。

苦豆子總堿原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC測(cè)定槐果堿的含量，僅僅測(cè)定單一成分槐果堿的含量難以反映苦豆子總堿中生物堿的實(shí)際含量狀況，因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定氧化苦參堿與苦參堿、氧化槐果堿與槐果堿含量，為制定苦豆子總堿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent LC-1220高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器；Mettler Toledo萬(wàn)分之一電子天平(上海儀器有限公司提供)。

1.2 試藥 氧化苦參堿對(duì)照品(批號(hào):110780-201007)，氧化槐果堿(批號(hào):111652-200301)，苦參堿對(duì)照品(批號(hào):110805-200508)均購(gòu)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所；槐果堿購(gòu)于寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司，純度≥98.0%。苦豆子總堿由寧夏中藥材開(kāi)發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心提供，為褐色的稠膏物；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀、濃氨水為分析純，超純水實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent TC-C18(2)(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈與0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(加三乙胺2.0 mL/L)；采用梯度洗脫，0～12 min～45 min，乙腈與磷酸二氫鉀比例為6∶94～10∶90～10∶90；檢測(cè)波長(zhǎng):205nm；流速:1.0mL/min；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃，理論塔板數(shù)以氧化苦參堿峰計(jì)不得低于10 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取氧化苦參堿對(duì)照品、氧化槐果堿對(duì)照品、苦參堿對(duì)照品和槐果堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含氧化苦參堿、氧化槐果堿約為0.16 mg，苦參堿、槐果堿約為0.12 mg的混合溶液，過(guò)0.45μm有機(jī)微孔濾膜，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。見(jiàn)圖1。

注:1氧化苦參堿；2氧化槐果堿；3苦參堿；4槐果堿。圖1 4種生物堿對(duì)照品色譜圖

2.3 供試品溶液的制備 取苦豆子總堿約0.3g，精密稱定，加甲醇溶解定容至100 mL量瓶中，混勻，過(guò)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，得供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。見(jiàn)圖2。在本色譜條件下，氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿分離良好，分離度均大于1.5。按供試品溶液制備方法得陰性對(duì)照溶液，色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)溶劑干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 陰性對(duì)照色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密稱定氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含氧化苦參堿0.4448mg、氧化槐果堿0.491 7 mg、苦參堿0.421 6 mg、槐果堿0.426 4 mg的混合溶液，精密量取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.5、5.0、8.0 mL至10 mL的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿的線性回歸方程分別為:

線性范圍分別為:22.24～355.8，24.58～393.4，21.08～337.3，21.32～341.1 mg/L，結(jié)果表明4種生物堿線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)色譜條件下，取混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿峰面積的RSD分別為1.00%、1.56%、0.68%、0.66%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一苦豆子總堿樣品溶液，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24小時(shí)進(jìn)樣10 μL檢測(cè)色譜峰峰面積。結(jié)果氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿峰面積的RSD分別為1.38%、1.75%、0.68%、3.89%。表明樣品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)苦豆子總堿供試品，精密稱取6份，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測(cè)定各生物堿含量，結(jié)果氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿的RSD分別為0.38%，1.51%、1.21%、1.18%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)已知含量的苦豆子總堿供試品6份，每份約0.15g，精密稱定，將甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，每份樣品分別精密加入氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿對(duì)照品，量與供試品中所含成分比例約為1∶1，用甲醇定容至刻度，混勻，即得加樣回收率供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿與槐果堿的平均回收率分別為99.10%，100.12%、98.76%、98.35%；RSD分別為1.15%、1.86%、1.64%、2.01%。

2.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取3批次苦豆子總堿樣品，依法制備供試品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，按外標(biāo)法計(jì)算生物堿百分含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 苦豆子總堿含量(以干燥品計(jì)算) %

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿和槐果堿在205 nm處有較大吸收，色譜峰對(duì)稱性良好，故選205 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相梯度洗脫 以乙腈-0.05 mol/mL磷酸二氫鉀溶液(2.0 mL/L三乙胺)為流動(dòng)相，考察不同梯度洗脫，1)0min→10 min→12min→45min，乙腈:磷酸二氫鉀為5∶95→8∶92→10∶90→10∶90；2)0min→13min→45min，乙腈∶磷酸二氫鉀為6∶94→10∶90→10∶90；3)0 min→12 min→45 min，乙腈∶磷酸二氫鉀為6∶94→10∶90→10∶90。結(jié)果“3)”的洗脫效果最好，4種生物堿與鄰近峰的分離度大于1.5。

苦參堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐果堿等是苦豆子植物的主要成分，并且氧化苦參堿、氧化槐果堿的含量高于苦參堿和槐果堿的含量［6-7］，表明在植物體內(nèi)氧化苦參堿、氧化槐果堿應(yīng)為較穩(wěn)定的天然存在形式，且提取過(guò)程中苦參堿與氧化苦參堿、槐果堿與氧化槐果堿存在著相互轉(zhuǎn)化［8-11］，因此測(cè)定苦豆子總堿含量時(shí)，不能忽略苦豆子提取過(guò)程中氧化型生物堿與還原型生物堿相互轉(zhuǎn)化的影響［12-13］，所以本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定氧化苦參堿和苦參堿、氧化槐果堿和槐果堿的含量，以便很好地控制苦豆子總堿質(zhì)量。

［1］ 秦學(xué)功，元英進(jìn).苦豆子種子中生物堿的冷浸提取實(shí)驗(yàn)研究［J］.中草藥，2001，32(7):604-605.

［2］ 焦河玲，鄧虹珠，王曉娟，等.苦豆子總堿對(duì)S180荷瘤小鼠的抑制作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(2):163-165.

［3］ 周婭，楊志偉，趙建寧，等.苦豆子總堿的體外抗菌活性研究［J］.2000，22(2):79-81.

［4］ 周毅，鄧虹珠，鄧子華，等.苦豆子總堿對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎CD 4+CD 25+，CD 8+CD 28-表達(dá)的影響［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(47):89-91.

［5］ 邢世瑞.寧夏中藥志上卷［M］.2版.銀川:寧夏人民出版社，2006:130.

［6］ 馬玲，王俊卿，田杰.H PLC同時(shí)測(cè)定苦豆草中7種生物堿的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(11):1483-1486.

［7］ 張福寶，狄天云，王漢卿.不同物候期苦豆籽中8種生物堿含量的變化分析［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2013，35(11):1066-1067.

［8］ 郭安.苦參堿和氧化苦參堿提取純化工藝研究［J］.西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26(2):37-39.

［9］ 冷曉紅，陳海燕，郭鴻雁，等.不同提取方法對(duì)苦豆子中氧化槐果堿與槐果堿含量的影響［J］.西北藥學(xué)雜志，2013，28(5): 457-458.

［10］肖吉元，陳有智，李平.苦豆子生物堿藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.西部中醫(yī)藥，2014，27(8)：165-168.

［11］郭鴻雁，冷曉紅.苦豆子籽總生物堿分離純化工藝研究［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28(10)：49-52.

［12］陳建國(guó).苦豆子總堿對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎SO D，M D A，N O，M PO表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31(4)：323-325.

［13］陳申，劉宇，強(qiáng)哲.苦豆子總堿對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2013(2)：34-36.

RP-HPLC Determination of the Contents of Matrine,Oxymatrine,Sophocarpine and Oxysophocarpine in Total Alkaloid of Sophora Alopecuraidesl

CHEN Haiyan,LENG Xiaohong,GUO Hongyan,LI Jun,HAO Caiqin
Ningxia polytechnic,Yinchuan 750021,China

Objective：To establish a RP-HPLC method for dertermination of the contents of oxyalkaloid and reduced alkaloid in total alkaloid of sophora alopecuraidesl.Methods：RP-C18bonded silica gel column was adopted, acetiontrile-0.05 mol/L potassium Bi-phosphate solution(triethylamine 2.0 mL/L was mobile phase,and gradient elution,the detection wavelength was 205nm,column temperature was 30 degrees celsius,the flow rate was 1.0mL/min.Results：Average recovery rate of matrine,oxymatrine,sophocarpine and oxysophocarpine were 99.10%,RSD was 1.15%,matrine was 98.76%;RSD was 1.64%,oxysophocarpine was 100.12%,RSD was 1.86%; sophocarpine was 98.35%,RSD was 2.01%.Conclusion：The method for dertermination of the contents of oxyalkaloid and reduced alkaloid in alkaloid of sophora alopecuraidesl is specific and highly sensitive,which can control the quality of total alkaloid of sophora alopecuraidesl effectively.

RP-HPLC;total alkaloid of sophora alopecuraidesl;oxymatrine;oxysophocarpine;matrine; sophocarpine;dertermination of contents

R284.1

A

1004-6852(2016)10-0033-03

2016-02-27

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(編號(hào)2011BA I05B00)。

陳海燕(1966—)，女，教授。研究方向:藥物分析檢驗(yàn)。