王愛(ài)玲 ， 蔡俊波，2 ， 李春燕 ， 李海敏 ， 郭抗抗

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西楊凌712100 ； 2.陜西省安康市石泉縣畜牧獸醫(yī)中心 ， 陜西石泉725200)

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陜西省某規(guī)?；i場(chǎng)仔豬腹瀉病原的分離鑒定

王愛(ài)玲1， 蔡俊波1，2， 李春燕1， 李海敏1， 郭抗抗1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西楊凌712100 ； 2.陜西省安康市石泉縣畜牧獸醫(yī)中心 ， 陜西石泉725200)

腹瀉是由傳染性因素和非傳染性因素引起的以腹瀉為主要癥狀的一種綜合征，是規(guī)?；i場(chǎng)仔豬常見(jiàn)的一種疾病。傳染性因素主要包括各種引起腹瀉的病原微生物，目前國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)常見(jiàn)的有病毒和細(xì)菌所引起。為確定發(fā)生腹瀉的原因，采取針對(duì)性的防控措施，本試驗(yàn)對(duì)3 只來(lái)自不同發(fā)病圈舍的腹瀉仔豬，進(jìn)行病理剖檢和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的PCR 檢測(cè)，進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，選敏感性藥物進(jìn)行治療使本次病情得以控制，也為臨床上類(lèi)似病例的診治提供參考，報(bào)告如下。

1 發(fā)病情況

2015年4月陜西省某規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生了仔豬腹瀉病情，排黃色漿糊狀稀糞、部分患豬發(fā)生死亡，經(jīng)諾氟沙星等抗生素治療，未見(jiàn)明顯效果。

2 臨床檢查

患病仔豬消瘦，精神不振，被毛粗糙，排黃色漿糊狀稀糞；剖檢發(fā)現(xiàn)該豬腸道臌脹并有黃色液體內(nèi)容物，腸黏膜脫落，腸系膜淋巴結(jié)有彌漫性出血小點(diǎn)，腸壁菲薄呈半透明狀。

3 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

3.1 病毒學(xué)檢測(cè) 無(wú)菌采集3只發(fā)病仔豬的小腸組織100 mg于勻漿器中充分研磨后加入1 mL滅菌生理鹽水提取總RNA，產(chǎn)物溶解于20 μL DEPC水中，-20℃?zhèn)溆谩?duì)提取的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成。參照GenBank公布的TGEV(DQ8117881.1)M基因、PEDV(EU302820.1)M基因利用Primer5.0基因分析軟件分別設(shè)計(jì)PEDV、TGEV 的檢測(cè)引物。引物序列如下：PEDV-F：5′-TTCCCGTTGATGAGGTGAT-3′；PEDV-R：5′-AAGCATTGACTGAACGACC-3′；TGEV-F：5′-AAACTTCTAAATGGCCAACCAGGGACAAC-3′；TGEV-R：5′-GCATCTCGTTTAGTTCGTTACCTCATCAATTATC-3′。PEDV 和TGEV 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段分別為552bp、1 168 bp，引物由北京華大基因科技服務(wù)有限公司合成。檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)PCR 擴(kuò)增，取10 μLPCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，對(duì)采集小腸中PEDV和TGEV的PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性，如圖1

圖1 病料中流行性腹瀉病毒和傳染性
胃腸炎病毒的PCR檢測(cè)

M：DNA Marker ；1：病料中PEDV ；2：PEDV陽(yáng)性對(duì)照；3：病料中TGEV ；4：TGEV陽(yáng)性對(duì)照

3.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

3.2.1 細(xì)菌分離 無(wú)菌取患豬肝臟、腸內(nèi)容物劃線(xiàn)于血平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)并取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢從腸內(nèi)容物和肝臟中各分離獲得一株細(xì)菌，在血平板上可見(jiàn)到針尖大小的白色單一菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象；革蘭染色鏡檢下可看到紅色。短小、單桿菌形態(tài)。根據(jù)培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)和染色鏡檢初步確定該菌為大腸埃希菌。

3.2.2 分離菌的生化鑒定 將疑似大腸埃希菌菌落接種于腸桿菌科細(xì)菌微量生化管中，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。結(jié)果表明，該分離的菌對(duì)葡萄糖、麥芽糖、乳糖試驗(yàn)均為陽(yáng)性，對(duì)枸櫞酸鹽等試驗(yàn)為陰性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

+：陽(yáng)性；

-：陰性

3.2.3 分離菌的測(cè)序及分析 根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]，以細(xì)菌的DNA為模板，來(lái)擴(kuò)增16s rRNA，測(cè)序并將測(cè)序序列登陸GenBank。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blasten分析后，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析?；驕y(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析表明該分離株與埃希大腸菌的16S rRNA基因同源性為98%，與志賀菌的16SrRNA基因同源性為98%，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的進(jìn)化分析(如圖2)結(jié)果表明，該分離株與大腸埃希菌相近。

圖2 分離菌基因組核酸序列進(jìn)化樹(shù)分析

處于同一類(lèi)群中，而與志賀菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此將該分離株歸類(lèi)為大腸埃希菌。

3.2.4 分離菌的藥敏試驗(yàn) 調(diào)整細(xì)菌濃度約5×107-8CFU/mL，取1 mL 菌懸液均勻涂布在MH 瓊脂平板上，將14 種常用藥敏紙片(10～30 μg/片)貼培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h 觀察抑菌圈大小。采用紙片擴(kuò)散法來(lái)檢測(cè)分離的大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)頭孢噻吩等藥物高度敏感；對(duì)頭孢唑林中度敏感；對(duì)氨芐西林、鏈霉素等藥物產(chǎn)生耐藥性，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

仔豬腹瀉是規(guī)?；i場(chǎng)常見(jiàn)的疾病，治療不及時(shí)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。引起腹瀉的病因最常見(jiàn)的有病毒和細(xì)菌。秦谷雨等對(duì)2011 年10月-2012年5月安徽地區(qū)37個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)采集腹瀉仔豬的186 份病料進(jìn)行TGEV 和PEDV 的PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率分別為59.1%和5.4%[2]。薛瑞雪等對(duì)2013-2014 年采集山東省部分地區(qū)豬場(chǎng)腹瀉仔豬的226 份病料進(jìn)行PEDV、TGEV 和PRoV 的PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率分別為34.96%、2.21%、28.76%[3]。也有大腸埃希菌為主要病原引起仔豬腹瀉的報(bào)道[4-5]。在發(fā)生腹瀉時(shí)及時(shí)確定病原是制定針對(duì)性防控措施的前提，盲目用藥、不對(duì)因治療，將會(huì)貽誤治療時(shí)機(jī)，造成疫情的擴(kuò)大。本文報(bào)道的豬場(chǎng)發(fā)生仔豬腹瀉后，在沒(méi)有確定病因的情況下，先用本場(chǎng)常用的抗菌藥物進(jìn)行治療，但未見(jiàn)到明顯效果，進(jìn)而懷疑為病毒感染引起，使用抗病毒藥物后依然沒(méi)有效果，使得疫情擴(kuò)大。實(shí)驗(yàn)室診斷發(fā)現(xiàn)引起本次疫情的病原為大腸埃希菌，只是在前期治療中沒(méi)有用到敏感的藥物。所以在發(fā)生仔豬腹瀉時(shí)及時(shí)確定病因，篩選敏感性藥物，采取針對(duì)性的措施是控制疫情的關(guān)鍵。

表2 分離菌的藥敏試驗(yàn)

注：抑菌圈(mm)d≥20 mm為高敏；15≤d≤20為中敏；d<15為耐藥

在回顧性調(diào)查中我們也發(fā)現(xiàn)，該豬場(chǎng)長(zhǎng)期在飼料中添加一種抗菌藥物以防控細(xì)菌感染，使細(xì)菌耐藥性增加，治療效果降低或沒(méi)有效果。所以為避免這種情況的發(fā)生，提高抗菌藥物的療效，要合理使用抗菌藥物，需要輪換用藥和定期進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，防止發(fā)生長(zhǎng)期使用對(duì)同一類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生交叉耐藥。由于引起腹瀉的病因復(fù)雜，及時(shí)確定病原，采取針對(duì)性的防治措施，做好生物安全措施，是防控病原性腹瀉的關(guān)鍵。

[1] 朱飛舟，陳利玉，陳漢春，等.16S rRNA基因序列分析法鑒定病原細(xì)菌[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，38(10)：1035-1041.

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2015-08-19

陜西省重點(diǎn)農(nóng)業(yè)科技推廣及示范項(xiàng)目(ZDKJ2014-33)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2014KTCQ02-02)

王愛(ài)玲(1990-)，女，碩士生，研究方向?yàn)樨i重要疫病防控技術(shù)研究，E-mail：1256028246@qq.com

郭抗抗，E-mail：guokk2007@nwsuaf.edu.cn

S858.28

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0529-6005(2016)10-0040-02