周艷飛 ， 李 浛 ， 王亞芳，李應(yīng)超 ， 魏 鐳 ， 王海軍

(1.北京市獸藥監(jiān)察所 ， 北京大興102629；2.北京生泰爾生物科技有限公司 ，北京大興102206 ； 3.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心 ， 北京大興102206)

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銀黃口服液含量測定方法的改進試驗

周艷飛1， 李 浛1， 王亞芳1，李應(yīng)超1， 魏 鐳1， 王海軍2，3

(1.北京市獸藥監(jiān)察所 ， 北京大興102629；2.北京生泰爾生物科技有限公司 ，北京大興102206 ； 3.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心 ， 北京大興102206)

為了建立同時測定銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷的高效液相色譜方法，采用Discovery C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，以乙腈-0.4%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長327 nm。結(jié)果目標(biāo)峰分離度良好，綠原酸和黃芩苷的質(zhì)量濃度與峰面積分別在1.00～20.05 μg/mL(R2=0.999 9)、10.07～201.55 μg/mL(R2=0.999 9)呈良好線性，平均加樣回收率分別為99.90%和100.73%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1.0%。表明此方法重復(fù)性好，專屬性強，可準(zhǔn)確、快速測定銀黃口服液中的綠原酸和黃芩苷含量。

銀黃口服液 ； 高效液相色譜法 ； 黃芩苷 ； 綠原酸

銀黃口服液是由黃芩與金銀花提取加工而成，具有抗菌、清熱解毒、消炎、退熱等作用，臨床上廣泛應(yīng)用于上呼吸道感染、急慢性扁桃體炎等癥的治療，療效確切[1]。銀黃口服液最早被列入新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第2冊(1993年)中，自2000年以來被歷版中國藥典收載。中國藥典(2010年版)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，分別進行金銀花和黃芩苷的含量測定，檢測時間相對長[2]。

目前，已有相關(guān)研究對銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷進行了同時含量測定，方法報道不一[3-6]。本試驗根據(jù)國家獸藥典委員會2015版獸藥典標(biāo)準(zhǔn)的要求，對銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷同時測量方法進行了系統(tǒng)的研究，為新版獸藥典中銀黃口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)變更提供試驗和數(shù)據(jù)支持。

1 材料

2695高效液相色譜儀，2487紫外檢測器(Waters 公司)；1100高效液相色譜儀，VWD紫外檢測器(Agilent公司)；e2695高效液相色譜儀，2489紫外檢測器(Waters公司)；XP205電子天平(上海梅特勒有限公司)；DT255 超聲清洗機(BANDELIN公司)。銀黃口服液，愛迪森(北京)生物科技有限公司提供，100 mL/瓶，批號1207271、1212031、1212211)；綠原酸對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號Z0260611，含量96.6%)；黃芩苷對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號Z0271109，含量98.8%)。HPLC 級乙腈，磷酸等其他試劑為分析級。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Discovery C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，檢測波長327 nm，進樣體積10 μL，以乙腈為流動相A，以0.4%磷酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速1 mL/min。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于2 000，按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于2 500。見表1。

表1

2.2 溶液制備

2.2.1 綠原酸對照品貯備液 精密稱取綠原酸對照品10.38 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶解后稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸貯備液。

2.2.2 黃芩苷對照品貯備液精密稱取黃芩苷對照品10.20 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃芩苷貯備液。

2.2.3 混合對照品溶液 分別精密量取綠原酸貯備液2 mL和黃芩苷貯備液25 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 樣品溶液 精密量取樣品1 mL，置50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取3 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定法 分別精密吸取混合對照品溶液與樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。數(shù)見圖1、圖2。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取綠原酸貯備液和黃芩苷貯備液適量，加50%甲醇稀釋制成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含綠原酸濃度分別為1.00、3.00、5.01、7.02、10.02、20.05 μg/mL，含黃芩苷濃度分別為10.07、30.03、50.39、70.54、100.78、201.55 μg/mL。按上述色譜條件進樣測定以對照品溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。綠原酸線性方程：Y=3.123 0×10-5X+0.034 0，R2=0.999 9，綠原酸濃度范圍在1.00～20.05 μg/mL，見圖1。黃芩苷線性方程：Y=5.047 9×10-5X-0.039 6，R2=0.999 9，黃芩苷濃度范圍在10.07～201.55 μg/mL，見圖3、圖4。

圖1 混合對照品

注：綠原酸峰的保留時間為9.084 min，黃芩苷峰的保留時間為19.951 min

圖2 供試品

注：綠原酸峰的保留時間為9.158 min，黃芩苷峰的保留時間為19.949 min

2.5 精密度考察 分別精密量取綠原酸和黃芩苷對照品溶液，按照2.1項下條件連續(xù)進樣6次，綠原酸和黃芩苷峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.76%，0.65%。

圖3 綠原酸線性圖

圖4 黃芩苷線性圖

2.6 重復(fù)性考察 取同一批號樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定應(yīng)不大于2.0%)分別為0.13%和0.32%。

2.7 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一批銀黃口服液供試品溶液，按照上述色譜條件，30 h內(nèi)分別每隔2 h進樣一次，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。數(shù)據(jù)見表2。

2.8 加樣回收試驗 本加樣回收試驗按照80%、100%、120%的量進行添加回收，即每個濃度制備3份平行樣，分別平行進樣3針。精密量取已知含量的銀黃口服液9份，每份1 mL，置100 mL棕色量瓶中，分別按照綠原酸和黃芩苷實際含量的80%、100%、120%精密加入綠原酸和黃芩苷，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取3 mL，置25 mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。所得數(shù)據(jù)見表3、表4。

表2 新方法溶液穩(wěn)定性考察

表3 綠原酸加樣回收試驗結(jié)果 (n=9)

表4 黃芩苷加樣回收試驗結(jié)果 (n=9)

2.9 色譜柱耐用性考察 分別采用不同的高效液相色譜儀和色譜柱，按照新方法色譜條件，分別精密吸取綠原酸和黃芩苷的混合對照品溶液、樣品溶液注入色譜儀測試。結(jié)果見表5。

表5 色譜柱耐用性考察

3 討論

3.1 樣品的制備 樣品溶液按照原方法進行制備，由于黃芩苷和綠原酸濃度相差10倍左右，本研究將綠原酸對照品溶液濃度降低10倍，以保持綠原酸良好的線性關(guān)系。選擇溶解供試品溶劑時，本研究考察了采用50%甲醇或水作為第一步的溶劑，結(jié)果顯示含量無差異，說明50%甲醇或水對銀黃注射液均具有良好的溶解性，考慮對照品溶液的溶劑為50%甲醇，所以最終選擇50%甲醇作為第一步溶解的溶劑。

3.2 流動相的選擇 原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中，綠原酸和黃芩苷的等度洗脫流動相不同，比例相差亦較大，為了采用同一種流動相同時對兩者進行含量測定，本研究參考文獻研究及兩者流動相溶劑和比例的基礎(chǔ)上[7-9]，有機相選用洗脫能力較強的乙腈進行梯度洗脫。洗脫時，先大比例水相分離出綠原酸，然后再提高有機相比例洗脫出黃芩苷，直至黃芩苷完全流出以及再無其他組分干擾后，逐漸過渡到最初比例平衡色譜柱，循環(huán)運行下一針。

3.3 波長選擇 文獻報道中[10-11]，黃芩苷檢測波長一般為274 nm，綠原酸檢測波長以327 nm居多。銀黃口服液中綠原酸含量遠(yuǎn)低于黃芩苷，為了得到目標(biāo)峰美觀的色譜圖，本方法選擇測定綠原酸的波長為綠原酸和黃芩苷同時測量的波長對兩者成分進行同時檢測。

4 結(jié)論

通過本方法所得目標(biāo)成分分離度好、理論塔板數(shù)高，方法穩(wěn)定可靠，可作為銀黃口服液的含量測定方法。實際檢測中，此方法操作相對簡單、快捷，檢測時間為較原方法縮短1 倍以上，大大提高了檢測效率，對促進實際檢測和生產(chǎn)具有積極的意義。

[1] 陳美娟，葛李，顧立，等.銀黃口服液抗菌作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18(1):107-108.

[2] 中國獸藥典委員會.《中華人民共和國獸藥典》2012 年版2部[S]．

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Study on the Improvement of determination of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang Oral Liquid by HPLC

ZHOU Yan-fei1， LI Han1， WANG Ya-fang1， LI Ying-chao1， WEI Lei1， WANG Hai-jun2，3

(1.Beijing Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 102629，China；2.Beijing Centre Biology Co.，Ltd，Beijing 102206，China；3.Beijing Veterinary Drugs Engineering Research Center，Beijing 102206，China)

To establish a HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang oral liquid,the Discovery C18(4.6×150 mm，5 μm)column was adopted with acetonitrile and 0.4% phosphoricacid solution was as the mobile phase and gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min-1，the volume of injection was 10 μL，and the detective wavelength was set at 327 nm.There were better linear relationships between the peak area and concentration at the range of 0.5～20 μg/mL(R2=0.999 8),5～199 μg/mL(R2=0.999 8)for chlorogenic acid and baicalin，respectively.The average recovery rates of chlorogenic acid and baicalin were 99.90% and 100.73%，respectively，and the RSD was less than 1.0%.The HPLC method is reproducible，specific，accurate，and can be used as a quantitative analysis of chlorogenic acid and baicalin in Yinhuang oral liquid.

Yinhuang Oral Liquid ； HPLC ； baicalin ； chlorogenic acid

WANG Hai-jun

2015-08-31

周艷飛(1972-)，女，高級獸醫(yī)師，大專，研究方向為獸藥質(zhì)量控制，E-mail：1956437829@qq.com

王海軍，E-mail：wtianlong86@126.com

R927.2

A

0529-6005(2016)10-0089-04