趙東海 ， 黃建玉 ， 唐際蘭 ， 何金林 ， 畢蓮茹

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 ， 吉林吉林132013)

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淫羊藿多糖對(duì)醋酸鉛致生精障礙小鼠的治療作用

趙東海1， 黃建玉2， 唐際蘭2， 何金林2， 畢蓮茹2

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 ， 吉林吉林132013)

為觀察淫羊藿多糖對(duì)生精障礙BALB/c小鼠的治療作用，將60只BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥物組、淫羊藿多糖高、中、低劑量組，每組10只；除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射醋酸鉛制備小鼠生精障礙模型。通過(guò)灌胃不同濃度淫羊藿多糖及陽(yáng)性藥物維生素E，研究了淫羊藿多糖對(duì)生精障礙小鼠精子數(shù)量、畸形率、活率，生殖激素水平及睪丸形態(tài)的影響。結(jié)果：淫羊藿多糖各劑量組能夠升高生精障礙小鼠精子密度和精子活率，降低精子畸形率,降低血清卵泡雌激素和黃體生成素水平，升高睪丸組織睪酮含量(P<0.01)，且各劑量組對(duì)生精功能改善作用呈劑量依賴性。形態(tài)學(xué)觀察，淫羊藿多糖可改善小鼠睪丸組織的病理學(xué)損害。表明淫羊藿多糖對(duì)醋酸鉛所致小鼠生精功能的損傷具有治療作用，作用機(jī)制可能與改善或恢復(fù)生殖內(nèi)分泌激素水平有關(guān)。

淫羊藿多糖 ； 醋酸鉛 ； 生精障礙 ； 生殖激素

近年來(lái)，因各種損傷因素的作用導(dǎo)致男性精液質(zhì)量呈不斷下降趨勢(shì)。研究表明，我國(guó)育齡夫婦不孕、不育發(fā)生率為12.5%。其中,因男性生育能力缺陷所致的不育者約占50%左右[1]，少精癥和(或)弱精癥等精子質(zhì)量異常是導(dǎo)致男性不育的主要原因[2]。傳統(tǒng)中藥方劑在改善男性生殖功能方面具有較好的效果[3-4]，但由于藥物種類多，成分復(fù)雜，使得中藥生精的藥理作用和相關(guān)機(jī)制尚未闡明，研究中藥有效成分在生精障礙中的作用和機(jī)制，對(duì)男性不育藥物的研發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物,其莖葉入藥,辛溫?zé)o毒,有堅(jiān)筋骨、益精氣、補(bǔ)腰腎、強(qiáng)心力等作用[5],為傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥。本試驗(yàn)，制備獲得淫羊藿有效成分淫羊藿多糖，通過(guò)腹腔注射醋酸鉛制備BALB/c小鼠生精障礙模型，，探討淫羊藿多糖對(duì)生精損傷小鼠生精功能的治療作用，為淫羊藿多糖在生精障礙中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，體重20±2 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(吉)2008-0005。

1.2 藥物與試劑 淫羊藿，購(gòu)自吉林大藥房(批號(hào)：20140913)。醋酸鉛：上?；瘜W(xué)試劑廠。卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)和睪丸組織勻漿睪酮(T)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 淫羊藿多糖的制備 淫羊藿100 g，洗凈剪碎并研磨成粉，，按參考文獻(xiàn)[6]方法并加以改進(jìn)，以水提醇沉法制備淫羊藿多糖。料水比為1∶25，提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為1.5h,提取次數(shù)為3次,醇沉濃度為700mL/L，得粗多糖。用氯化鈣除蛋白，加活性炭脫色，透析除去無(wú)機(jī)鹽，獲得淫羊藿多糖。用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量，以葡聚糖溶液為對(duì)照品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品含糖量約為58.2 mg/g。

1.4 模型制備及動(dòng)物分組處理 60只BALB/c小鼠以單純隨機(jī)抽樣法分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥物組以及淫羊藿多糖低、中、高劑量組，每組10只。除正常組外，給予其余5組BALB/c小鼠腹腔注射醋酸鉛20 mg/(kg·d)，連續(xù)7 d，制備生精障礙模型。造模后，淫羊藿多糖低、中、高劑量組分別給予淫羊藿多糖50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，陽(yáng)性藥物組維生素E 10 mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組均灌胃等體積生理鹽水，均每天1次，連續(xù)30 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 取材 末次給藥24 h后全部小鼠稱體重，腹主動(dòng)脈取血并分離血清。右側(cè)睪丸放入4%福爾馬林固定行組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)。左側(cè)取附睪和睪丸，其中睪丸制成勻漿，以3000 r/min離心10 min，取上清液。附睪進(jìn)行精子密度、精子畸形率及精子活率檢測(cè)。

1.5.2 精子密度、畸形率及活率檢測(cè) 取單側(cè)附睪，剪碎組織并放入預(yù)熱至37 ℃精子營(yíng)養(yǎng)液[7]中，37 ℃靜止10 min，使精子充分游離釋放，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算精子密度；另取5 μL 精子懸液與等量伊紅- Y 混勻，室溫下放置10 min，加蓋玻片，光鏡下觀察，死精子呈粉紅色，活精子不著色而呈胞質(zhì)透明，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，計(jì)算精子活率；另從試管中取5 μL 精子懸液，甲醇固定5 min，2%伊紅水溶液染色1 h，用高倍鏡按順序檢查精子形態(tài)，頭部無(wú)鉤、香蕉形、胖頭等形態(tài)精子判定為畸形，每只小鼠檢查完整的精子1 000 個(gè)，計(jì)算精子畸形率。

1.5.3 生殖激素測(cè)定 取分離后血清及睪丸組織勻漿液，利用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定血清FSH 和LH 及睪丸組織勻漿T 水平，試驗(yàn)步驟和方法按照試劑盒說(shuō)明書完成。

1.5.4 睪丸組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取小鼠睪丸石蠟切片，H.E.染色，光鏡觀察睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿多糖對(duì)小鼠精子密度、畸形率及活率的影響 由表1可見(jiàn)，模型組小鼠精子密度和精子活率均低于正常對(duì)照組，精子畸形率高于正常組(P<0.01)。與模型組相比，淫羊藿多糖劑量組精子密度、精子活率增高，精子畸形率降低(P<0.01)。淫羊藿多糖對(duì)精液質(zhì)量的改善隨藥物濃度的增高，作用效果也更明顯，存在劑量依賴關(guān)系。陽(yáng)性藥物組對(duì)精子功能改善作用與200 mg/kg 淫羊藿多糖劑量組相似。

表1 淫羊藿多糖對(duì)各組小鼠精子密度、活率及畸形率影響 ±s,n=10)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01,#P<0.05,；與模型組比較△P<0.01；與50 mg/kg組比較▽P<0.01;與100 mg/kg組比較▲P<0.01

2.2 淫羊藿多糖對(duì)小鼠生殖激素的影響 由表2可見(jiàn)，模型組小鼠血清FSH和LH含量均高于正常組，睪丸組織勻漿T含量低于正常組(P<0.01)。與模型組相比，淫羊藿多糖各劑量組FSH和LH含量降低，睪丸組織勻漿T含量升高(P<0.01)。淫羊藿多糖對(duì)生殖激素含量的影響隨藥物濃度的增高，作用效果也更明顯，存在劑量依賴關(guān)系。

表2 淫羊藿多糖對(duì)小鼠血清FSH、LH和睪丸組織T含量的影響

組別(mg/kg)劑量mg/kgFSH(U/L)LH(U/L)T(nmol/L)正常對(duì)照組-3.32+0.584.87+0.969.58+0.84模型組-6.44+0.87*8.29+0.83*2.98+0.65*淫羊藿多糖組505.94+0.63*△7.72+0.61*△3.68+0.84*△1004.82+1.38*△▽6.19+0.36*△▽5.52+0.54*△▽2003.73+0.21#△▽▲5.13+0.68#△▽▲7.23+0.34#△▽▲陽(yáng)性藥物組103.87+0.69#△▽▲5.29+0.34#△▽▲7.88+0.62#△▽▲

注：與正常對(duì)照比較，*P<0.01,#P<0.05,；與模型組比較△P<0.01；與100 mg/kg組比較▽P<0.01;與200 mg/kg組比較▲P<0.01

2.3 淫羊藿多糖對(duì)小鼠睪丸形態(tài)影響 結(jié)果見(jiàn)中插彩版圖1，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠睪丸生精小管排列紊亂，生精上皮層數(shù)明顯變少，生精細(xì)胞數(shù)量變少，排列紊亂，腔內(nèi)成熟精子少。淫羊藿多糖各劑量組睪丸組織形態(tài)有不同程度改善，生精小管逐漸密集，生精上皮數(shù)量不斷增多，淫羊藿多糖對(duì)受損睪丸形態(tài)學(xué)改善作用隨藥物濃度的增高，效果也更明顯，存在劑量依賴關(guān)系。

3 討論

鉛是重金屬之一，長(zhǎng)期接觸鉛而導(dǎo)致的中毒是我國(guó)慢性職業(yè)中毒的主要原因[8]。鉛不僅對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有毒性作用，而且對(duì)生殖系統(tǒng)也會(huì)造成損傷[9]，鉛可以通過(guò)血-睪丸屏障沉積在睪丸生精小管及管周組織，進(jìn)而對(duì)睪丸產(chǎn)生損傷毒害作用[10]。本研究結(jié)果證實(shí)，20 mg/kg 醋酸鉛連續(xù)腹腔注射7 d可導(dǎo)致小鼠精子密度減少、活率降低及畸形率的增高，小鼠睪丸也出現(xiàn)組織學(xué)改變，導(dǎo)致睪丸損傷的發(fā)生。

淫羊藿是傳統(tǒng)的藥用植物，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)的作用，主治陽(yáng)萎早泄，腰酸腿痛，神經(jīng)衰弱等，是改善男性生殖功能常用的組方藥[11]。淫羊藿多糖是淫羊藿的重要有效成分，藥理學(xué)研究表明，淫羊藿多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激損傷、延緩衰老及調(diào)節(jié)免疫的作用[12-14]。本研究利用水提醇沉法制備獲得淫羊藿多糖，并檢測(cè)了不同濃度淫羊藿多糖對(duì)醋酸鉛致生精障礙小鼠的治療作用。結(jié)果證實(shí)：淫羊藿多糖各劑量組均可不同程度升高精子密度，增加精子活率并降低精子畸形率，表明淫羊藿多糖對(duì)小鼠受損傷睪丸和精子的形成具有明顯的治療作用。睪丸形態(tài)學(xué)檢測(cè)證實(shí)，淫羊藿多糖作用后可改善睪丸生精小管損傷的作用。提示，淫羊藿多糖具有治療和恢復(fù)損傷生精上皮的作用。

精子的發(fā)生和正常發(fā)育是保證精子數(shù)量和質(zhì)量前體條件。睪丸生精小管內(nèi)保持較高濃度的T對(duì)促進(jìn)精子發(fā)生具有重要作用[15]。在人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)中，下丘腦-垂體-性腺軸內(nèi)分泌激素水平尤其是雄性生殖激素的含量，調(diào)控著精子的發(fā)生過(guò)程及睪丸局部T含量，這其中FSH、LH的含量及變化對(duì)精子的發(fā)生及質(zhì)量的影響最為重要。FSH、LH 為垂體分泌的糖蛋白類激素，F(xiàn)SH可與其位于生精小管的支持細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，促進(jìn)或增加性激素結(jié)合蛋白的產(chǎn)生，使睪丸組織中T濃度維持在較高水平。LH則具有刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌T的作用，不僅可提高睪丸局部T含量，而且可與FSH協(xié)同作用促進(jìn)精子的成熟，并與精子的活動(dòng)力有關(guān)[16]。有研究證實(shí)，F(xiàn)SH和LH水平可作為睪丸生精功能的預(yù)測(cè)指標(biāo)，如果FSH明顯增高，提示睪丸生精功能嚴(yán)重受損，如果LH升高越明顯提示睪丸受損可逆性越差[17]。

本試驗(yàn)中，模型組小鼠睪丸組織勻漿T含量降低，結(jié)合精液質(zhì)量結(jié)果，提示鉛中毒后可影響精子產(chǎn)生，造成生精功能障礙。同時(shí)，血清FSH、LH含量增高，提示T含量降低可通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制作用于丘腦-垂體-性腺軸，進(jìn)而促進(jìn)FSH、LH分泌增多，使血中兩種生殖內(nèi)分泌激素含量升高。淫羊藿多糖干預(yù)后，睪丸組織T含量增高，而且睪丸形態(tài)損傷也明顯好轉(zhuǎn)，血中FSH、LH含量降低。提示，淫羊藿多糖可刺激生精上皮再生，減輕睪丸組織損傷，升高睪丸局部T含量，恢復(fù)丘腦-垂體-性腺軸的內(nèi)分泌調(diào)控作用而提高精子數(shù)量和質(zhì)量，從而治療因鉛中毒引發(fā)的生精障礙。

綜上所述，淫羊藿多糖能有效治療因醋酸鉛導(dǎo)致的生精障礙，提高精子數(shù)量和活率，降低精子畸形率，提高睪丸局部T含量，降低血清FSH、LH含量，并能夠減輕或恢復(fù)受損睪丸組織形態(tài)，從而改善生精功能。

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2015-09-09

趙東海(1975-),男,副教授，博士，從事生殖病理研究工作，E-mail：zdh1027@sina.com

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0529-6005(2016)10-0029-03