鄭艷雅 溫新意 袁培根 林麗娜 倪純玨 趙喜越

右美托咪啶抑制NF-κB活化減輕肢體缺血再灌注損傷的研究

鄭艷雅 溫新意 袁培根 林麗娜 倪純玨 趙喜越

目的 探討右美托咪啶預處理對抑制NF-κB活化及減輕肢體缺血再灌注損傷的影響及機制。方法 將21只成年雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+右美托咪啶預處理組（DEX組），每組各7只。DEX組在麻醉后腹腔注射右美托咪啶25μg/kg，其余兩組給予相應體積的0.9%氯化鈉溶液，30min后單側股部切口，無創(chuàng)動脈夾夾閉股動脈，用橡皮筋以恒定張力結扎該側肢體，Sham組僅行股部手術、分離股動脈不夾閉，其余兩組缺血3h后去除動脈夾及橡皮筋。采用ELISA法檢測血清IL-1、IL-6、TNF-α，Western blot檢測胞核NF-κB，光鏡觀察腓腸肌形態(tài)，并測定濕/干重比值。結果 顯微鏡下可見Sham組大鼠腓腸肌肌纖維排列整齊、間質少有炎性細胞浸潤，I/R組大鼠腓腸肌肌纖維排列紊亂并出現(xiàn)明顯水腫、間質中出現(xiàn)大量炎癥細胞，DEX組大鼠腓腸肌肌纖維排列欠規(guī)則、間質中有少量炎性細胞，但較I/R組有所好轉。與Sham組相比，I/R組濕/干重比值、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB水平均明顯升高（均P＜0.05）；與I/R組相比，DEX組濕/干重比值、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB水平均明顯降低（均P＜0.05）。結論 右美托咪啶可抑制NF-κB信號通路活化，減輕肢體缺血再灌注損傷。

缺血/再灌注損傷 NF-κB 右美托咪啶

肢體缺血再灌注損傷是指肢體在缺血一段時間后恢復血流灌注，骨骼肌的損傷不但沒有減輕反而有所加重。肢體缺血再灌注損傷在臨床上比較常見，如腹主動脈手術、斷肢再植、遠端血管重建術等均會造成一定程度的肢體缺血再灌注損傷[1]。因此，尋找有效的治療手段來預防或減輕缺血再灌注損傷具有重要意義。近年來，隨著對右美托咪啶研究的深入，發(fā)現(xiàn)其不僅具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗交感活性和穩(wěn)定血流動力學的特點[2]，在心[3]、肺[4]等重要器官的缺血再灌注損傷中均有一定的保護作用，Xu等[5]發(fā)現(xiàn)右美托咪啶對肢體缺血再灌注損傷也有保護作用，這與其抗氧化抗炎作用有關，但對于其器官保護作用具體機制尚未明確。有報道指出肢體缺血再灌注后，機體的NF-κB信號通路被激活，進而促發(fā)一系列的炎癥因子產生，導致骨骼肌因炎癥反應而發(fā)生損傷[6]，這也是造成缺血再灌注損傷的一個重要因素。本研究通過觀察肢體缺血再灌注損傷后大鼠的NF-κB及其相關炎癥因子的變化，以及右美托咪啶對NF-κB信號通路活化和肢體缺血再灌注損傷的影響，初步探討右美托咪啶對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護機制，為臨床預防和治療肢體缺血再灌注損傷提供新的治療靶點及途徑。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠21只，SPF級，體重280～320g；由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。低溫離心機、酶標儀（美國Thermo公司）；垂直電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）；胞質胞核蛋白提取試劑盒（普利萊基因技術有限公司）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG（英國Abcam公司）；核內參TBP（美國Bioworld Technology公司）；BCA Protein Assay Kit（美國Thermo公司）；右美托咪啶注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。

1.2 動物模型的建立與分組 按隨機數(shù)字表法將21只SD大鼠分為假手術組（Sham組）、肢體缺血再灌注組（I/R組）、肢體缺血再灌注+右美托咪啶預處理組（DEX組）3組，每組7只。將25%烏拉坦和10%水合氯醛1:1混合液5ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠眼睫毛反射和刺激下肢反射消失后，右下肢股部切口分離股動、靜脈，用無創(chuàng)動脈夾夾閉，用橡皮筋穿過動、靜脈，以恒定張力環(huán)扎該側肢體，觀察到大鼠該側肢體由紅潤色變成暗紫色，說明缺血成功；夾閉3h后松開動脈夾及橡皮筋恢復血供，2h后將大鼠取血、處死，并取該側腓腸肌檢測。DEX組缺血前30min腹腔注射右美托咪啶25μg/kg，其它兩組給予相應體積的0.9%氯化鈉溶液，Sham組僅行股動、靜脈分離術不夾閉。

1.3 腓腸肌濕/干重比值測定 切取腓腸肌，即刻稱取濕重，然后置于55℃恒溫干燥箱中至恒重即為干重，采用濕重與干重的比值來反映腓腸肌的水腫程度。

1.4 腓腸肌形態(tài)觀察 腓腸肌置于10%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察腓腸肌組織形態(tài)變化。

1.5 ELISA法檢測血清IL-1、IL-6、TNF-α水平 依照試劑盒說明書分別采用抗大鼠IL-1、IL-6、TNF-α單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的IL-1、IL-6、TNF-α與單抗結合，加入生物素化的抗大鼠IL-1、IL-6、TNF-α，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，通過繪制標準曲線得到IL-1、IL-6、TNF-α水平。

1.6 Western blot檢測腓腸肌NF-κB的表達 依照試劑盒說明書提取胞核蛋白，采用BCA法測定濃度。蛋白在10%SDS-PAGE中室溫電泳分離，NF-κB（300mA、70min）濕轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加NF-κB（稀釋度1∶2 000）和TBP（稀釋度1∶500）一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10min/次，加入生物素標記的二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，10min/次，ECL化學發(fā)光法覆蓋條帶，暗室中顯影、定影，將膠片沖洗后晾干。膠片掃描后，采用Image J測定各目的條帶的吸光度（A）值，并以目的蛋白和相應內參的A值比值表示目的條帶相對強度。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnet′t檢驗。

2 結果

2.1 各組腓腸肌濕/干重比值的比較 Sham組濕/干重比值較??；與Sham組比較，I/R組骨骼肌濕/干重比值明顯升高（P＜0.05）；與I/R組比較，DEX組濕/干重比值降低（P＜0.05），詳見表1。

表1 各組腓腸肌濕/干重比值的比較

2.2 各組腓腸肌形態(tài)變化 橫切面觀察發(fā)現(xiàn)：Sham組，肌纖維呈多邊形結構規(guī)則排列，未見細胞腫脹，間質結構正常，血管周圍未見明顯炎癥細胞滲出；I/R組細胞排列不規(guī)則，染色明顯變淡、界限不清晰，細胞腫脹明顯，間質見彌散的紅細胞，血管周圍可見大量炎癥細胞浸潤；DEX組細胞排列欠規(guī)則，細胞染色稍有變淡、界限欠清晰，間質偶見紅細胞，血管周圍有少量炎性細胞浸潤，但與I/R組相比有明顯好轉，詳見圖1。

圖1 各組骨骼肌的病理改變（a：Sham組；b：I/R組；c：DEX組；HE染色，×400）

2.3 各組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的比較 Sham組IL-1、IL-6、TNF-α水平較低；與Sham組相比，I/R組IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯升高（均P＜0.05）；與I/R組相比，DEX組IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯降低（均P＜0.05），詳見表2。

表2 各組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的比較（pg/ml）

2.4 各組腓腸肌NF-κB表達的比較 Sham組胞核NF-κB電泳條帶A值與內參TBP電泳條帶A值的比值較??；與Sham組比較，I/R組胞核NF-κB A值與內參A值得比值升高（P＜0.05）；與I/R組比較，DEX組胞核NF-κB A值與內參A值的比值顯著降低（P＜0.05），詳見表3。

表3 各組骨骼肌NF-κB表達的比較

3 討論

本實驗通過常用阻斷血管的方法成功制作了肢體缺血再灌注損傷模型，進一步證實了右美托咪啶對肢體缺血再灌注損傷有保護作用，這與文獻報道相一致[5,7]。同時筆者也發(fā)現(xiàn)，右美托咪啶可以下調肢體缺血再灌注損傷后的NF-κB核內轉移，使相關炎癥因子生成減少，減輕肢體缺血再灌注所造成的損傷。

肢體缺血再灌注損傷是臨床診療中不可忽視的一個問題，越來越多的證據(jù)顯示炎癥反應在肢體缺血再灌注損傷中起到了舉足輕重的作用，而IL-1、IL-6、TNF-α等大量炎癥因子的釋放是炎癥反應發(fā)生、發(fā)展的關鍵[8]，同時作為轉錄因子NF-κB的激活是上述基因表達的前提。隨著研究的深入，NF-κB對炎性分子轉錄的調控、在細胞凋亡中的作用逐漸引起人們重視。目前已經證實，NF-κB的結合序列存在于多種基因的啟動子區(qū)域，包括IL-1、IL-6、TNF-α等[9]。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物中NF-κB家族的亞單位有5種：Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel（Rel）、NF-κB1（p105/p50）和NF-κB2（p100/p52），Western blot檢測的具體是針對亞基為Rel-A（p65）。它們通常以同源二聚體或異源二聚體非活性形式與其抑制蛋白I-κB形成復合物，存在于幾乎所有類型細胞的胞質。當I-κB磷酸化、被蛋白酶降解，NF-κB會從NF-κB-I-κB復合物中解離出來并轉位于細胞核，與相應的靶基因結合[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R組較Sham組NF-κB表達增多（P＜0.05），這與文獻報道相一致[6]，同時還發(fā)現(xiàn)，DEX組大鼠較I/R組NF-κB表達降低（P＜0.05），這說明右美托咪啶可以減少NF-κB的核內轉移。

IL-1由激活的巨噬細胞及幾乎所有的有核細胞產生，可促發(fā)多種體內炎癥反應如發(fā)熱、血管阻力降低、毛細血管通透性增加等；IL-6為巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞所分泌的一種炎癥介質且能被IL-1和TNF-α所誘導，是急性期反應的主要細胞因子[11]；TNF-α是主要由單核細胞和巨噬細胞產生的一種單核因子，是肢體缺血再灌注損傷過程中的始動因子[8]，可提高中性粒細胞的吞噬能力，刺激內皮細胞對IL-1、IL-6的分泌[12]，并促進中性粒細胞和內皮細胞的黏附，進而促進機體局部炎癥反應及組織損傷的擴大。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，I/R組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯增高（P＜0.05），表現(xiàn)為缺血腓腸肌的濕/干重比值明顯增多（P＜0.05），而與I/R組相比，DEX組IL-1、IL-6、TNF-α水平及濕/干重比值均明顯降低（均P＜0.05）。同時HE染色發(fā)現(xiàn)，Sham組肌纖維排列整齊、間質少有炎性細胞浸潤，I/R組肌纖維排列紊亂并出現(xiàn)明顯水腫、間質中出現(xiàn)大量炎癥細胞，DEX組肌纖維排列欠規(guī)則、間質中有少量炎性細胞，但較I/R組有所好轉。

綜上所述，右美托咪啶可以減少肢體缺血再灌注損傷骨骼肌NF-κB的核內轉移，促使 IL-1、IL-6、TNF-α在內的炎癥因子生成減少，降低肢體缺血再灌注后骨骼肌的損傷。

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Dexmedetomidine reduces ischemia-reperfusion injury in skeletal muscle via suppressing activation of NF-κB

ZHENG Yanya,WEN Xinyi，YUAN Peigen,et al.Department of Anesthesiology,Wenzhou People's Hospital,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of dexmedetomidine (DEX)on skeletal muscle injury induced by ischemia-reperfusion and related mechanisms. Methods Twenty-one SD rats were randomly divided into sham-operated group(sham group),ischemia-reperfusion(I/R)group and I/R+DEX group.In DEX group,DEX(25μg/kg)was injected after anesthesia;while in the other groups,the same volume of saline was also injected.After 30 minutes,the hind limb ischemia was induced by clamping the common femoral artery and ligating collateral circulation.After 3h of ischemia,the clamp and tourniquet were removed and the rats underwent reperfusion for 2h.The plasma concentrations of IL-1,IL-6 and TNF-α were measured with enzyme-linked immunosorbent assay.The gastrocnemius muscle was harvested,the expression of NF-κB protein was detected by Western blot;the morphological changes were observed with HE staining;the wet/dry ratio was also measured. Results The intact muscle fiber and few inflammatory cells infiltration in interstitial space were observed with light microscopy in sham group.Disordered arrangement and edema of muscle fibers and interstitial inflammatory cells infiltration were showed in I/R group.In DEX group,the disordered arrangement of muscle fiber and infiltration of inflammatory cells in the stroma were attenuated as compared to I/R group.The wet/dry ratio,plasma levels of TNF-α and NF-κB were higher in I/R group than those in sham group(P＜0.05).The wet/dry,plasma IL-1,IL-6,TNF-α levels and NF-κB expression were significantly lower in DEX group than those in I/R group(P＜0.05). Conclusion Dexmedetomidine can reduce the ischemia-reperfusion injury of skeletal muscle,which is associated with the inhibition of NF-κB activation.

Reperfusion injury NF-κB Dexmedetomidine

2015-10-16）

（本文編輯：嚴瑋雯）

溫州市科技計劃項目（Y20140561）

325000 溫州醫(yī)科大學溫州市第三臨床學院、溫州市人民醫(yī)院麻醉科（鄭艷雅、溫新意）；溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科（袁培根、林麗娜、倪純玨、趙喜越）

趙喜越，E-mail：544649314@qq.com