夏利龍 具晟 袁豐 祝鑫海 舒躍 陳國平

●論 著

RNA干擾HO-1表達(dá)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究

夏利龍 具晟 袁豐 祝鑫海 舒躍 陳國平

目的 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制血紅蛋白加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)，觀察HO-1對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。方法 將體外構(gòu)建的HO-1小分子RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染入肺腺癌A549細(xì)胞，分為空白對(duì)照組（b lank組）、脂質(zhì)體組（mock組）、陰性對(duì)照組（NC組）、HO-1 siRNA組；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法檢測HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平；分別以CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖能力和凋亡率，用Transwell試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)48、72h后，與b lank組、mock組、NC組比較，HO-1 siRNA組細(xì)胞存活率均降低（均P＜0.05），細(xì)胞凋亡率均增高（均P＜0.05），G0期/G1期細(xì)胞比例均增高（均P＜0.05），Transwell試驗(yàn)中穿膜細(xì)胞數(shù)均減少（均P＜0.05）。結(jié)論 RNA干擾HO-1基因表達(dá)后能有效調(diào)控肺腺癌A549細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，降低細(xì)胞的侵襲能力。

肺腫瘤 HO-1 RNA干擾

血紅蛋白加氧酶-1（HO-1）是體內(nèi)血紅蛋白降解的重要限速酶，HO-1基因也是體內(nèi)重要的細(xì)胞保護(hù)基因，各種氧化應(yīng)激和炎癥因子均能誘導(dǎo)HO-1基因的表達(dá)[1]。研究表明，人類多種惡性腫瘤中該基因表達(dá)水平增高，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤中HO-1與腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的免疫組織化學(xué)研究提示，HO-1在NSCLC中有較高的表達(dá)水平，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性[3]。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制HO-1的表達(dá)，觀察HO-1對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響，以期進(jìn)一步在細(xì)胞和分子水平為HO-1可能作為肺癌基因治療的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 熒光定量PCR試劑盒購自上海生物工程有限公司，HO-1兔抗購自美國Abcam公司，DNA引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國GIBCO公司，細(xì)胞周期試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司。肺腺癌A549細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，在浙江醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及小分子RNA（siRNA）構(gòu)建 肺腺癌A549細(xì)胞生長于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，在含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞融合50%~70%時(shí)更換無血清培養(yǎng)基Opti-MEM進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。3對(duì)靶向干擾HO-1的siRNA（分別命名為HO-1 siRNA組、HO-1 siRNA1組、HO-siRNA2組）及1對(duì)熒光標(biāo)記的siRNA由美國Ambion公司化學(xué)合成。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HO-1mRNA的表達(dá)水平按照Trizol說明書步驟提取總RNA，按M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Thermo Scientific Fermentas公司）操作說明書合成cDNA：HO-1（forward：5′-CCAGCAACAAAGTGCAAGATTC-3′；reverse：5′-GGTAAGGAAGCCAGCCAAGAG-3′；產(chǎn)物長度287bp）、β-actin（forward：5′-AAGATGACCCAGATCATGTTTGA-3′；reverse：5′-TTAATGTCACGCACGATTTCC-3′；產(chǎn)物長度240bp）。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，94℃ 45s，64.5℃ 90s，72℃ 60s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min；計(jì)算HO-1/β-actin比值，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測HO-1蛋白的表達(dá)水平 提取30μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酸胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗4℃封閉過夜（1∶2 000稀釋的HO-1），二抗室溫封閉2h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測、X線曝光；用QuantityOne軟件行灰度值分析，計(jì)算HO-1/GAPDH比值，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，離心計(jì)數(shù)后，以2×103/well鋪96孔板，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)，24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（blank組）、脂質(zhì)體組（mock組）、陰性對(duì)照組（NC組）、HO-1 siRNA組，分別培養(yǎng)48、72h；按操作說明書進(jìn)行各組細(xì)胞A值檢測，細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%；試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，以2×105/well鋪4塊6孔板，24h后加無血清無抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液同步化24h；培養(yǎng)48h和72h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，消化細(xì)胞，微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速1 500r/min，離心時(shí)間5min，棄培養(yǎng)基用冷PBS洗滌細(xì)胞2次（1 500r/min，離心時(shí)間5min），用100μl 1X Binding Buffer懸浮細(xì)胞；在細(xì)胞懸浮液中加入5μl Annexin V-FITC和1μl PI，輕輕混勻后4℃避光條件下孵育 15min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，以2×105/well均勻鋪于6孔板，24h后加無血清無抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液同步化24h；分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞并分別培養(yǎng)48h和72h；消化細(xì)胞，微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速1 500r/ min，離心時(shí)間5min，加冰75%乙醇在4℃固定24h以上；微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速1 500r/min，離心時(shí)間5min后棄乙醇，風(fēng)干，加PBS洗2遍（1 500r/min，離心時(shí)間5min），加入1ml Reagent A振蕩混勻5~10 s，孵育30min；用流式細(xì)胞儀檢測各周期細(xì)胞比例；試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 Transwell試驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將在4℃融好的Matrigel用冷的PBS稀釋，取100μl稀釋膠(約25μg)加到24孔Transwell上室；放置37℃孵育過夜包被基底膜，取出Transwell板，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基輕洗凝膠；消化、收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，制備5×104/ml、1%FBS RPMI-1640細(xì)胞懸液，取200μl加入上室，下室加入600μl培養(yǎng)基；37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱孵育24h；用棉簽擦去上室非侵襲細(xì)胞，移去Transwells，倒置，風(fēng)干；在24孔板中加入500μl含0.1%結(jié)晶紫，把小室放入其中，37℃孵育30min；取出小室，PBS清洗；直徑上取3個(gè)視野、照相、計(jì)數(shù)取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HO-1 siRNA組、HO-1 siRNA1組、HO-siRNA2組、mock組及NC組細(xì)胞HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 見表1。

表1 HO-1 siRNA組、HO-1 siRNA1組、HO-siRNA2組、mock組及NC組細(xì)胞HO-1mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

由表1可見，各組細(xì)胞HO-1mRNA和蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；與mock組、NC組細(xì)胞比較，HO-1 siRNA組、HO-1 siRNA1組、HO-siRNA2組mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），且HO-1 siRNA組mRNA和蛋白表達(dá)水平均最低（均P＜0.05）。這表明HO-1 siRNA序列是有效的靶基因干擾序列。

2.2 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞存活率比較 見表2。

表2 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞存活率比較（%）

由表2可見，與blank組、mock組、NC組比較，HO-1 siRNA組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞存活率均降低（均P＜0.05）；而blank組、mock組、NC組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞存活率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.3 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞凋亡率比較 見表3。由表3可見，與blank組、mock組、NC組比較，HO-1 siRNA組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞凋亡率均增高（均P＜0.05）；而blank組、mock組、NC組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞凋亡率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

表3 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞凋亡率比較（%）

2.4 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)

48、72h后各周期細(xì)胞比例比較 見表4。

表4 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)48、72h后各周期細(xì)胞比例比較（%）

由表4可見，與blank組、mock組、NC組比較，HO-1 siRNA組培養(yǎng)48、72h后G0期/G1期細(xì)胞比例均增高（均P＜0.05），S期細(xì)胞比例均降低（均P＜0.05），G2期/ M期細(xì)胞比例比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；而blank組、mock組、NC組培養(yǎng)48、72h后各周期細(xì)胞比例比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.5 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞侵襲能力比較見圖1、表5。

表5 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)48、72h后細(xì)胞侵襲能力比較

由圖1、表5可見，與blank組、mock組、NC組比較，HO-1 siRNA組培養(yǎng)48、72h后穿膜細(xì)胞數(shù)均減少（均P＜0.05）；而blank組、mock組、NC組培養(yǎng)48、72h后穿膜細(xì)胞數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

3 討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見腫瘤，由于肺癌細(xì)胞存在較強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征，因此肺癌患者預(yù)后較差。目前在世界范圍內(nèi)，肺癌已成為癌癥病亡的主要原因[4]。從基因水平找到有效的靶點(diǎn)來控制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

HO-1是體內(nèi)血紅蛋白分解代謝重要的限速酶，其分解的產(chǎn)物分別為一氧化碳（CO）、膽綠素和Fe2＋。CO通過激活P3細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶（p38-MAPK）及sGC/cGMP信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用；而膽綠素可以通過抑制某些細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白阻斷細(xì)胞增殖；Fe2＋的細(xì)胞保護(hù)作用也已被證實(shí)，但具體機(jī)制尚未明確[5-6]。目前發(fā)現(xiàn)，HO-1在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)水平增高，并與腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[2]。一項(xiàng)對(duì)NSCLC的免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HO-1在NSCLC中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。以往多數(shù)研究利用藥物（如SnPPIX、ZnPPIX、ZnMPIX等）抑制HO-1的表達(dá)，但這些藥物可能通過調(diào)控細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）、caspase-3、caspase-8對(duì)腫瘤細(xì)胞起抑制作用，而不依賴HO-1的表達(dá)[8-9]。因此，本研究通過RNA干擾技術(shù)靶向抑制肺腺癌A549細(xì)胞HO-1的表達(dá)，觀察對(duì)其細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，在細(xì)胞和分子水平上，為HO-1可能作為肺癌基因治療的靶點(diǎn)提供更多的理論依據(jù)。

圖1 HO-1 siRNA組、blank組、mock組及NC組培養(yǎng)48、72h后穿膜細(xì)胞鏡下所見（結(jié)晶紫染色，×100）

本研究針對(duì)HO-1的不同靶點(diǎn)化學(xué)合成3對(duì)HO-1 siRNA，為篩選干擾效果最好的HO-1 siRNA，本研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法檢測HO-1mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示3條構(gòu)建的siRNA在mRNA和蛋白水平對(duì)HO-1都有抑制作用，然后選取干擾效果最好的HO-1 siRNA進(jìn)行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；應(yīng)用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HO-1 siRNA的細(xì)胞增殖能力顯著下降、細(xì)胞凋亡率明顯增高，細(xì)胞周期停滯在G0期/G1期；Transwell檢測結(jié)果顯示細(xì)胞侵襲能力降低，這可能與HO-1對(duì)VEGF[10]、MMP-9[11]等相關(guān)侵襲因子的調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，靶向干擾HO-1基因表達(dá)后能有效抑制肺腺癌A549細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，但如何安全、有效地針對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行治療仍然需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究。

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Effect of silencing HO-1 gene expression on biological behavior of lung adenocarcinoma A549 cells

XIA Lilong,JU Sheng,YUAN Feng,et al.Department of Thoracic Surgery,Zhejiang Hospital,Hangzhou 310013,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of silencing heme oxygenase-1(HO-1)gene exp ression by RNA interference(RNAi)on p roliferation and invasiveness of human lung adenocarcinoma A549 cells in vitro. Methods The small interfering RNA(siRNA)targeting HO-1 gene was constructed and transfec ted into A549 cells.Reverse transcrip tionpolymerase chain reaction(RT-PCR)and Western b lotwas used to detect the silencing effectof HO-1 exp ression.The assays of cellcounting kit-8(CCK-8),flow cytometry and Transwellwere performed to assess the malignant phenotypes of transfected A549 cells. Results The p roliferation of interference g roup was marked ly decreased (P＜0.05).The apop tosis rate was significanthigher in the interference g roup(P＜0.05),and the number of cells in Go/G1 phase was marked ly increased(P＜0.05). The number ofm igrated cells in interference group was significant higher than those in non-transfected control g roups(P＜0.05). Conclusion Silencing HO-1 gene exp ression by RNA interference can significantly induce cellapop tosis,and inhibit the p roliferation and m igratory capacity of lung adenocarcinoma A549 cells in vitro．

Lung neop lasms HO-1 RNA interference

2015-11-07）

（本文編輯：李媚）

310013 杭州，浙江醫(yī)院胸外科

夏利龍，E-mail：532089305@qq.com