王 博，王 琳

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低強度循環(huán)載荷訓練對髕骨髕腱結合部損傷和髕骨微細結構的影響

王 博，王 琳

目的：本研究利用循環(huán)載荷動物模型，比較休息和低強度運動對髕骨髕腱結合部(patella-patella tendon junction, PPTJ)損傷及對髕骨的影響。實驗方法：12只成年雌性新西蘭大白兔，隨機篩選分組分為4周循環(huán)載荷組(LD-RST，n=6)，8周循環(huán)載荷組(LD-LI，n=6)，左后肢進行實驗，右后肢為空白對照。實驗過程中，前4周兩組實驗動物統(tǒng)一接受強度為7.17N/S共24小時的循環(huán)載荷。在實驗的第4周后，LD-RST組停止實驗，LD-LI組將強度改為4.2N/共24小時的循環(huán)載荷。8周后所有動物統(tǒng)一進行取材，將取材后組織進行Micro-CT進行并進行H&E染色，使用圖像采集系統(tǒng)進行組織學分析。結果：H&E染色測量纖維軟骨帶厚度LD-LI組和LD-RST組沒有顯著差異，LD-LI組的膠原排列比LD-RST組更加緊密整齊。骨量和骨小梁結果顯示實驗組和對照組沒有顯著差異。結論：4周休息不能促進髕腱結合部損傷的恢復。4周低強度的循環(huán)載荷沒有加重損傷和髕骨增生，并且對肌腱的重建修復具有促進作用。

髕骨髕腱結合部損傷；循環(huán)載荷；損傷修復

髕骨髕腱結合部(patella-patella tendon junction, PPTJ)損傷是一種在籃球等長期半蹲位發(fā)力的運動項目高發(fā)運動損傷，對運動員的運動成績和生活質量都有較大影響。目前認為，高強度的過度使用是導致其損傷的主要原因。髕骨作為膝關節(jié)屈伸的力量支點，在垂直方向長時間受到力量的牽拉作用，因此髕骨與髕腱的結合部被是損傷的好發(fā)區(qū)域[1]。髕腱結合部損傷的主要組織學表現為纖維軟骨帶厚度增加、纖維軟骨與鈣化軟骨之間的潮線出現鋸齒狀的“漲潮”和模糊的現象，以及肌腱中膠原纖維的排列出現紊亂等，甚至出現髕腱結合部的骨質增生與鈣化的問題[1-2]。與此同時，骨組織在受到外界力學條件變化后，會根據相應的力學變化改變自身的微細結構和組織密度，以適應力學條件的變化[3]。目前在對髕腱結合部損傷的治療方法中，低強度的離心運動被認為可效減輕末端病中的紅腫熱痛等癥狀[4-6]，同時也有研究指出低強度的向心運動雖然治療效果不如離心運動，但是同樣具有減輕相應癥狀的效果[7-8]。這些研究主要集中臨床方面，缺少相關的組織學方面研究，且休息或運動是否可以促進組織修復目前依舊存在爭論。由于低強度運動會對肌腱病的治療具有積極的影響，因此我們假設通過低強度的循環(huán)載荷訓練會改善髕腱結合部的組織學損傷，并且對于骨的微細結構重建產生影響。本研究通過建立動物損傷模型，運用組織學和Micro-CT技術比較休息和低強度運動對髕腱結合部損傷及對髕骨的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

12只成年18周齡體重為2 400±200g的雌性新西蘭大白兔，隨機分為4周載荷4周休息組(LD-RST，6只)；4周載荷4周低強度訓練組(LD-LI，6只)。6個實驗動物的左后肢為實驗腿，隨機選取6個右后肢為對照組。

1.2 運動負荷

在之前的實驗中，刺激兔股四頭肌產生節(jié)律性收縮的最大電壓為12V，超過12V則會產生肌肉震顫。本實驗依據之前所建立的動物損傷模型[9]，并已知兔股四頭肌在12V下電刺激所產生的最大伸膝力為23.5N±2.4N[9]。實驗中采用30%最大負荷既7.17N(±0.3N)進行4周的循環(huán)載荷實驗可以確保造模成功。從第五周開始采用10%最大伸膝力量測試低強度循環(huán)載荷訓練對髕腱結合部損傷的影響。

1.3 循環(huán)載荷損傷運動

實驗動物根據體重進行腹腔注射戊巴比妥鈉(批號：018K0754；CAS注冊號：57-33-0，SIGMA，美國。濃度：2.5%；劑量：40mg/kg。)麻醉。兔子完全麻醉后仰臥固定于兔架臺上，雙膝屈曲90度。將連接正極與電刺激輸出裝置(型號：YC-2，成都儀器廠，中國)的刺激針刺入兔子雙側股直肌中部，負極刺入股直肌髕骨止點上20mm處。實驗時左下肢作為實驗組接通電刺激肌肉運動，而右下肢不接通電刺激作為對照組。實驗過程中通過調電壓的強度(1-12V)來控制并維持兔子伸膝力的強度，伸膝力通過張力轉換器(型號：YP100，北京新航業(yè)科貿有限公司，中國)將力學脈沖信號傳導到多通道信號采集處理器(型號：RM-6240C，成都儀器廠，中國)，以監(jiān)控整個實驗過程的伸膝力強度。

在前4周，LD-RST組和LD-LI組兔子的伸膝力強度控制在7.17N(±0.3N)，骨四頭肌每分鐘收縮20次，每次訓練2小時，每周訓練3次，即兩組均進行24小時循環(huán)載荷訓練。LD-RST組在第四周后停止訓練，繼續(xù)飼養(yǎng)，籠中自由活動。同時8周組從第五周開始伸膝力強度控制在最大伸膝力的10%即4.2N(±0.3N)，每次訓練2小時，每周訓練3次，LD-LI組共進行48小時載荷訓練(圖1)。

圖1 循環(huán)載荷損傷模型

1.4 樣本取材

第九周對所有動物注射過量戊巴比妥鈉處死，離斷股四頭肌止點，剪斷內外側副韌帶和膝關節(jié)內的十字韌帶，剝離髕腱下脂肪墊，將整個髕骨和髕腱結合部區(qū)域完整取下。

1.5 Micro-CT掃描

取材后標本立即進行Micro-CT掃描(skyscan 1072，美國GE公司)。掃描參數設定為：射線管電壓59KV，電流159 uA，掃描分辨率9um，曝光時間600ms，采用180度掃描，采用NRecon軟件(V1.6.1.0，美國GE公司)對原始圖像中髕骨下緣至髕骨中部480層圖像進行重建。隨后對重建后所得的連續(xù)橫切面灰度圖像使用CTAn(V2.11, 美國GE公司)進行綜合分析。根據Wang等[10]文獻報道，重建圖像灰度值區(qū)間設定為70-200可以有效清除清楚組織內部雜質對實驗結果的干擾。隨后得到完整的髕骨3D圖像，并計算髕骨體積(BV)、髕骨面積(BS)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨小梁數量(Tb.N)。(圖2)。

圖2 A髕腱的三維圖像 B髕骨的三維圖像

1.6 組織學H&E染色

Micro-CT掃描后樣本放入10%甲醛溶液內固定48小時，之后使用4%甲酸溶液進行為期三周時間的脫鈣。脫鈣之后，沿髕骨矢狀面對PPTJ組織縱向切開，進行組織脫水、石蠟包埋。待石蠟塊成型后，使用石蠟切片機沿縱切面將組織切為5 um厚的石蠟切片，并對其進行伊紅蘇木精(H&E)染色。

對圖像纖維軟骨厚度帶的測量采用之前已經建立的方法[11]。將整個纖維軟骨帶視為一個近似的矩形，使用MetaMorph Premier Offline(V7.7，美國)在100倍圖像上位于軟骨和肌腱之間一個帶狀區(qū)域中選取纖維與軟骨細胞的交界部分，將其范圍準確劃出并計算出其面積。然后將纖維軟骨帶的中線劃分出圖像的長軸，將纖維軟骨帶的面積除以長軸的長度，得到纖維軟骨帶的厚度。

1.7 統(tǒng)計分析

對各組結果間纖維軟骨帶厚度、髕骨體積(BV)、髕骨面積(BS)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨小梁數量(Tb.N)，采用ANOVA進行統(tǒng)計分析差異性檢驗，P<0.05證明存在顯著差異性。

2 實驗結果

2.1 H&E染色結果

H&E組織學染色結果顯示，對照組纖維軟骨帶與肌腱之間的潮線清晰明顯，膠原排列整齊、分布比較均勻，呈波浪形。LD-RST組出現了潮線輪廓模糊甚至局部消失的現象，膠原纖維的排列呈波浪狀，但排列紊亂；LD-LI組髕腱結合部的潮線輪廓出現鋸齒狀變化，肌腱膠原纖維排列平坦且致密。(圖3)

與對照組相比，LD-RST組纖維軟骨帶厚度明顯高于對照組(190.99±21.72um2，154.22±27.78 um2，P<0.05)，LD-LI組纖維軟骨帶厚度也明顯高于對照組(195.91±12.01um2，154.22±27.78 um2，P<0.05)。LD-RST組纖維軟骨帶厚度與LD-LI組纖維軟骨帶厚度無明顯變化(190.99±21.72um2，195.91±12.01um2，P>0.05)。(表2)

圖3 100倍鏡下的髕腱結合部的H&E染色和偏振光切片

表1 H&E染色測量纖維軟骨厚度Table 1 The thickness of the fibrocartilage by H&E staining

2.2 髕骨體積面積

使用Micro-CT計算髕骨體積(BV)、髕骨面積(BS)和總體積(TV)，結果顯示：對照組BV為36.31±6.05mm3，BS為98.71±18.75mm2，TV為116.24±21.49mm3；LD-RST組BV為34.67±7.68mm3，BS為95.58±21.73mm2，TV為116.77±18.70mm3；LD-LI組BV為：33.01±6.04mm3，BS為：95.37±20.16 mm2，TV為：108.57±16.90mm3。差異性檢驗結果顯示LD-LI組、LD-RST組和對照組在 BV、BS、TV未見顯著差異(P>0.05)。(見表2)

表2 髕骨體積與髕骨面積Table 2 The patella volume and patellar area

2.3 骨小梁數量與厚度

使用Micro-CT計算骨小梁厚度(Tb.th)和數量(Tb.N)，結果顯示：對照組Tb.th為1.06±0.14mm，Tb.N為0.23±0.01 (1/mm)；LD-RST組的Tb.th為1.03±0.26mm，Tb.N為0.28±0.03(1/mm)；LD-LI組Tb.th為1.04±0.11mm，Tb.N為0.31±0.02(1/mm)；差異性檢驗結果顯示，LD-LI組、LD-RST組和對照組在Tb.th、Tb.N未見顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 骨小梁的數量和厚度Table 3 The trabecular number and thickness

3 討論

根據文獻報道[1-2,9,12]，對于髕腱結合部損傷的H&E染色組織學表現為：肌腱纖維紊亂；潮線呈現“火焰狀”變化，模糊甚至消失；纖維軟骨帶增厚。通過鏡下觀察H&E染色結果顯示，LD-RST組出現了腱纖維結構紊亂，潮線模糊，部分乃至消失；LD-LI組出現了潮線鋸齒狀的變化。通過H&E染色測量纖維軟骨帶厚度，結果LD-LI組和LD-RST組的纖維軟骨帶厚度明顯大于對照組。

3.1 髕腱結合部組織學變化

髕腱結合部損傷多為外力作用肌腱進行反復的牽拉。肌腱組織在收到牽拉后導致炎癥因子升高引起紅腫熱痛等炎癥反應，同時肌腱組織自身進行重建和修復。而在長期反復的牽拉過程中，肌腱一直處于不斷的損傷，重建、修復狀態(tài)，從而導致過度修復和肌腱細胞凋亡。久而久之，這種過度修復作用會形成瘢痕愈合，影響肌腱原有的特性，導致髕腱結合部損傷的發(fā)生[2,13]。纖維軟骨帶厚度的增加被認為是由于髕腱結合部受到反復牽拉后產生的一系列細胞凋亡與增殖的結果，H&E染色切片中的LD-RST和LD-LI的纖維軟骨帶厚度顯著高于照組，其纖維軟骨帶的厚度分別是對照組的123.8%和122.5%(P均<0.05)，并且出現了潮線輪廓的變化，根據過往之前的研究結果[1-2，9，14]，可以確定4周總計24小時的循環(huán)載荷訓練有效造成髕骨髕腱結合部造模損傷。LD-LI組對比LD-RST組的纖維軟骨帶厚度無顯著性差異，說明傷后休息4周和4周的閾下強度循環(huán)載荷訓練均未對纖維軟骨帶厚度產生影響。

LD-LI組在低強度的循環(huán)載荷運動的作用下，肌腱膠原排列平坦而緊密，而LD-RST組的膠原排列雖然已經恢復膠原中原有的波紋形態(tài)，但肌纖維的排列依舊呈現出紊亂。肌腱的重建與外界的力學變化具有緊密的聯系，當肌腱受到的應力作用增加時，肌腱細胞大量合成現金屬蛋白酶對肌腱中的膠原纖維進行水解[15]，同時生成新的膠原纖維對組織進行重建，而低強度的力學作用會促使組織釋放如VEGF、TGF-β等因子，加速損傷的修復進行[16]。肌腱膠原纖維波紋排列的消失被認為是肌腱在牽拉力作用下所產生結構改變[12]，LD-LI由于在四周后依舊受到持續(xù)低強度的力學牽拉作用，肌腱膠原排列雖然呈現平坦，但膠原的排列緊密；LD-RST組在沒有額外牽拉力的情況下，膠原纖維排列重現呈現出波紋狀，但膠原排列紊亂。由此可見，雖然閾下強度循環(huán)載荷運動加強不能影響髕腱結合部纖維軟骨帶厚度，但相對LD-RST組的膠原纖維結構，LD-LI組的膠原纖維重新形成了緊密的結構，因此我們認為低強度循環(huán)載荷訓練可以促進肌腱的重建。

3.2 骨量與骨微細結構變化

髕骨下緣作為髕腱通附著點，承受著從髕腱傳遞而來的縱向牽拉力作用，由于長期受到牽拉作用，髕尖區(qū)域是骨質增生的好發(fā)區(qū)域，也是髕腱結合部損傷后期的常見癥狀之一，而低強度的牽拉力是否會引起髕骨下緣的骨質增生尚不明確。通過Micro-CT計算結果顯示，LD-RST組、LD-LI組與對照組的髕骨體積(BV)與髕骨面積(BS)無顯著差異；骨小梁厚度(Tb.th)與骨小梁數量(Tb.N)結果無顯著差異。骨小梁是骨重建的重要指標，其變化是指示骨組織中成骨細胞和破骨細胞活性以及骨組織應對外界力學條件變化的結果；骨體積和骨面積的變化是骨小梁重建的最終結果，是整個骨重建的宏觀體現[10]。在一般情況下，骨骼的成骨和破骨處于一個相對的穩(wěn)定的動態(tài)平衡。而外界壓力和牽拉力的長時間增高并超出閾值時，這種平衡關系就會被打破。此時，成骨細胞的活性大大超過破骨細胞，使骨小梁密度增高，骨量增加。在對大鼠骨小梁結構與力學關系的研究中[17]，懸吊大鼠進行每天進行1小時的站立可以改善骨小梁數量和厚度降低的情況，但與對照組依舊存在顯著差異，而且懸吊組和1小時站立組的骨小梁數量和密度沒有顯著差異。在前一階段的實驗結果中顯示[13]在髕骨髕腱結合部損傷造模后，會出現局部骨質增生的情況。而在本研究中，LD-RST和LD-LI組與對照組髕骨下緣區(qū)域的骨量和骨小梁結構均沒有顯著差異。由此我們推測，LD-RST組在進行4周實驗后，在后4周由于停止載荷訓練，骨的微細結構恢復到對照組水平；而在LD-LI組由于后4周處于損傷閾下強度訓練，其載荷強度不足以維持骨小梁已經重建的結構，且由于肌腱牽拉力的降低，導致已經重建的骨微細結構對外界力學變化進行再次進行重建，使得骨微細結構恢復到接近對照組水平。髕腱結合部髕骨骨質增生是骨腱結合部損傷后期常見的癥狀，而損傷閾下強度的循環(huán)載荷訓練并沒有增加髕骨的骨密度以及骨小梁厚度和數量。由此我們認為損傷閾下強度的循環(huán)載荷運動不會引起髕骨骨質增生。

4 結論

本研究通過4周循環(huán)載荷進行損傷造模，通過組織學角度證明4周休息不能促進髕腱結合部損傷的恢復。4周損傷閾下強度的循環(huán)載荷沒有加重損傷和髕骨增生，并且對肌腱的重建修復具有促進作用。低強度訓練對促進髕腱結合部傷后早期恢復具有可行性，其效果有待進一步研究。

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(編輯 孫君志)

The Effect of Low Intensity Cyclical Load on the Patella-patella Tendon Junction Injury and Patella Microstructure

WANG Bo, WANG Lin

Objective: This study was to compare the effects of rest and low intensity exercise on tendon patella-patella junction (PPTJ) injury and patella with a cyclic loading animal injury model. Experiment design: 12 adult female New Zealand white rabbits were randomly assigned to a four-week cyclical load group (LD-RST,n=6) and a 8-week cyclical load group (LD-LI, n=6). During the experiment in the first 4 weeks, the two groups of rabbits received cyclical load of 7.17N/S·24 hours. After four weeks, the experiment on the LD-RST group was stopped and the load on the LD-LI group was changed into 4.2N/S·24 hours. After 8 weeks, tissues were collected from all the rabbits. The collected tissues were first scanned by Micro-CT and treated by H&E staining and then used for histological analysis by the image acquisition system. Results: There was no significant difference between the LD-LI group and the LD-RST group in the thickness of the fibrocartilage by H&E staining, and the collagen array in the LD-LI group is tighter and more regular than the LD-RST group. There is no significant difference in patellar microstructure between the experimental group and the control group. Conclusion: 4 weeks of rest can not promote the recovery of bone tendon junction injury. 4 weeks of low intensity of cyclic loading did not aggravate the damage and patella hyperplasia, and can promote the tendon reconstruction and repair.

TendonPatella-patellaJunction(PPTJ)Injury;CyclicalLoad;TendonRepair

G804.5 Document code：A Article ID：1001-9154(2016)02-0088-05

國家自然科學基金項目(30871209)。

王博，北京體育大學在讀博士，研究方向：運動損傷與肌腱末端病，E-mail：wangbodc002@163.com。

北京體育大學運動康復系，北京 100084 Beijing Sports University, Beijing 100084

2015-10-29

2016-01-29

G804.5

A

1001-9154(2016)02-0088-05