姚嘉赟，徐 洋，袁雪梅，藺凌云，尹文林,潘曉藝，郝貴杰，沈錦玉

( 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省魚(yú)類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州，313001 )

丁香酚的分離及其殺多子小瓜蟲(chóng)活性研究

姚嘉赟，徐 洋，袁雪梅，藺凌云，尹文林,潘曉藝，郝貴杰，沈錦玉

( 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省魚(yú)類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州，313001 )

利用不同極性大小的溶劑石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇回流提取丁香制備粗提物，進(jìn)行殺滅多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)和包囊的藥效活性追蹤，確定丁香殺蟲(chóng)的活性部位為石油醚提取部分，進(jìn)而利用硅膠柱層析和中壓制備液相等分離技術(shù)結(jié)合活性追逐試驗(yàn)追蹤分離丁香石油醚提取物(對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)和包囊的100%致死質(zhì)量濃度分別為50 mg/L和80 mg/L)，最終分離獲得一種殺蟲(chóng)活性物質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜、核磁氫譜、核磁碳譜等多種波譜分析技術(shù)確定該活性物質(zhì)為丁香酚。體外殺蟲(chóng)結(jié)果表明，丁香酚對(duì)多子小瓜蟲(chóng)具有較強(qiáng)的殺滅作用，其對(duì)幼蟲(chóng)15 min、1 h、2 h、3 h和4 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度分別為6.21 (5.85～6.65) mg/L、3.50 (3.24～3.84) mg/L、2.90 (2.62～3.22) mg/L、2.33 (2.10～2.50) mg/L 和2.15 (1.98～2.32) mg/L，對(duì)幼蟲(chóng)4 h的100%殺滅的質(zhì)量濃度為3.5 mg/L，對(duì)包囊6 h的100%殺滅質(zhì)量濃度為3.5 mg/L。結(jié)果表明，丁香酚是一種具有較好開(kāi)發(fā)前景的殺多子小瓜蟲(chóng)藥物。

丁香酚；多子小瓜蟲(chóng)；活性追蹤；殺蟲(chóng)活性

多子小瓜蟲(chóng)(Ichthyophthiriusmultifilis)，屬纖毛門、寡膜綱、膜口目、凹口科、多子小瓜蟲(chóng)屬，是一種世界性分布的淡水魚(yú)類專性寄生蟲(chóng)，其幾乎能感染所有的淡水魚(yú)類，患多子小瓜蟲(chóng)病的魚(yú)死亡率很高，一旦患有多子小瓜蟲(chóng)病就難以治愈，因此多子小瓜蟲(chóng)病被稱為魚(yú)類的“癌癥”，給我國(guó)乃至世界的淡水魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

對(duì)于多子小瓜蟲(chóng)病的防治，國(guó)內(nèi)外已做了大量的研究工作，倪達(dá)書(shū)[2]在20世紀(jì)60年代就篩選出用醋酸亞汞治療多子小瓜蟲(chóng)病，并對(duì)醋酸亞汞的治療機(jī)理和治療用量都做了闡述。但由于醋酸亞汞的毒性強(qiáng)，早已被禁止在食用魚(yú)上使用。同樣，對(duì)多子小瓜蟲(chóng)病療效較好的孔雀石綠，也因?yàn)閷?duì)人體有致癌性和毒性，已被禁止在食用魚(yú)上使用[3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)多子小瓜蟲(chóng)病治療的研究也比較多，如用辣椒和生姜、五倍子、食鹽、生石灰等治療多子小瓜蟲(chóng)，但這些藥物大多數(shù)對(duì)掠食體階段有一定效果，而對(duì)滋養(yǎng)體階段效果不明顯。國(guó)外用于防治多子小瓜蟲(chóng)病的藥物和方法也較多，甲醛[4]、葉綠酸[5]、溴硝醇[6]、高錳酸鉀[7]和高鐵酸鉀[8]等，但這些藥物和方法都受到一定的限制，對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的滋養(yǎng)體和包囊階段效果不明顯。同時(shí)，長(zhǎng)期使用帶來(lái)的環(huán)境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問(wèn)題，也成為目前食品安全和水產(chǎn)品出口的綠色貿(mào)易壁壘問(wèn)題，因此，尋找對(duì)多子小瓜蟲(chóng)病的治療行之有效、環(huán)境友好型藥物是一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。

天然植物資源作為自然資源的一大寶庫(kù)，蘊(yùn)藏著巨大的潛力，具有結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣性的活性物質(zhì)，因此在有效創(chuàng)制醫(yī)藥、獸藥和農(nóng)藥等新藥及探索具有生物活性的先導(dǎo)化合物等方面越來(lái)越受到重視和青睞。同時(shí)，具有低毒、低殘留、對(duì)非靶標(biāo)生物毒害較低，對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，可降低或避免目前化學(xué)藥物帶來(lái)的“藥物公害”。筆者也一直致力于從天然植物中尋找新型的殺蟲(chóng)藥物，利用提取分離技術(shù)從天然植物博落回和小果博落回中分離到3 種化合物血根堿[9]、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿[10]，對(duì)多子小瓜蟲(chóng)具有較強(qiáng)的殺滅作用。前期篩選中，發(fā)現(xiàn)丁香的提取物具有殺多子小瓜蟲(chóng)的作用，因此本研究利用提取分離技術(shù)并結(jié)合殺蟲(chóng)活性追蹤法分離丁香中的殺蟲(chóng)活性成分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為開(kāi)發(fā)新的殺蟲(chóng)藥物奠定基礎(chǔ)，并為尋求新的殺蟲(chóng)母體藥源，研究殺蟲(chóng)活性成分并進(jìn)行仿生合成提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

丁香(Eugeniacaryophyllata)購(gòu)自安徽中藥材市場(chǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)用魚(yú)

金魚(yú)(Carassiusauratus)，體長(zhǎng)(7.4±1.8) cm，嚴(yán)重感染多子小瓜蟲(chóng)，購(gòu)自湖州市花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)，草魚(yú)(Ctenopharynodonidellus)體質(zhì)量(13.8±2.7) cm，來(lái)自浙北水產(chǎn)新品種繁育技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 儀器與試劑

R-210/215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi)，Olympus-BX51顯微鏡(日本)，石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等化學(xué)試劑均為分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 多子小瓜蟲(chóng)的活體傳代

將感染有多子小瓜蟲(chóng)的金魚(yú)與草魚(yú)混養(yǎng)于80 cm×60 cm×60 cm的階梯式PP循環(huán)養(yǎng)殖水槽，水溫控制為(22±1) ℃，溶解氧>5 mg/L，水體經(jīng)砂層過(guò)濾。每3日換水50%，感染約7 d，魚(yú)體表面即可出現(xiàn)密集的小白點(diǎn)，可用于多子小瓜蟲(chóng)的收集以及幼蟲(chóng)的培養(yǎng)，同時(shí)要注意及時(shí)加入未感染的草魚(yú)，未使用的病魚(yú)應(yīng)及時(shí)撈出以免免疫力提高而影響蟲(chóng)體傳代。

1.2.2 蟲(chóng)體的收集與培養(yǎng)

將嚴(yán)重感染多子小瓜蟲(chóng)的草魚(yú)放置于玻璃缸中，并于玻璃缸底部放置5～10個(gè)塑料培養(yǎng)皿，待成熟蟲(chóng)體黏附于培養(yǎng)皿底部后，收集蟲(chóng)體。一部分蟲(chóng)體用于多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)(掠食體)的培養(yǎng)，一部分用于包囊的收集。

1.2.3 體外殺多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)(掠食體)試驗(yàn)

藥液的配制：各提取物及活性單體經(jīng)旋轉(zhuǎn)干燥后，精確稱取10 mg，溶解于二甲基亞砜并放置于冰箱保存?zhèn)溆?。待進(jìn)行藥效試驗(yàn)時(shí)取出，并利用曝氣的自然水稀釋至所需質(zhì)量濃度后進(jìn)行體外殺蟲(chóng)試驗(yàn)。

試驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，于每個(gè)細(xì)胞孔中加入約2 mL不同質(zhì)量濃度的藥液和約100個(gè)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)，于用藥后15 min、1 h、2 h、3 h、4 h鏡檢觀察一次，4 h后統(tǒng)計(jì)各孔的多子小瓜蟲(chóng)死亡率。試驗(yàn)設(shè)置二甲基亞砜對(duì)照組和充分曝氣自然水對(duì)照組，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：蟲(chóng)體纖毛不運(yùn)動(dòng)，胞質(zhì)不流動(dòng)，胞膜破裂，細(xì)胞核破碎。

1.2.4 體外殺多子小瓜蟲(chóng)包囊的試驗(yàn)

試驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，于每個(gè)細(xì)胞孔中均加入不同質(zhì)量濃度的藥液和30個(gè)多子小瓜蟲(chóng)包囊，于用藥后6 h，吸出藥液，加入充分曝氣的自然水。于22 ℃下培養(yǎng)24 h后先鏡檢觀察各孔的包囊存活及蟲(chóng)體孵化情況，之后將有幼蟲(chóng)孵化的細(xì)胞孔利用移液槍混勻，并吸取10 μL液體用1%甲醛固定后計(jì)數(shù)，進(jìn)而計(jì)算各孔的包囊孵化蟲(chóng)數(shù)。每孔取5次樣品，去平均值，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

包囊孵化蟲(chóng)數(shù)=每孔孵化蟲(chóng)體數(shù)/包囊個(gè)數(shù)

多子小瓜蟲(chóng)包囊死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：包囊破裂、未分裂或包囊未孵出幼蟲(chóng)。

1.2.5 丁香殺蟲(chóng)活性部位的確定

稱取丁香粉末50 g，利用不同極性溶劑(石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇)分別進(jìn)行提取，溶劑的使用量500 mL，每次提取2 h，并合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后用于體外殺蟲(chóng)試驗(yàn)，并根據(jù)藥效結(jié)果確定丁香的殺蟲(chóng)活性部位。

1.2.6 殺蟲(chóng)活性追逐試驗(yàn)

稱取5 kg丁香粉，用石油醚回流連續(xù)提取3次，合并提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后濕法上硅膠柱層析，依次用石油醚、石油醚∶乙酸乙酯、乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，每200 mL洗脫液作為一個(gè)餾分，共收集476個(gè)餾分，經(jīng)TLC合并為5個(gè)組分(FrA:1～78; FrB: 79～156; FrC: 157～268; FrD:269～378; FrE:379～476)。對(duì)這6個(gè)組分進(jìn)行體外殺蟲(chóng)(掠食體和包囊)試驗(yàn)，其中FrC對(duì)多子小瓜蟲(chóng)掠食體和包囊的殺滅效果最強(qiáng)，故而利用中壓制備系統(tǒng)(Flash)對(duì)FrC以石油醚∶乙酸乙酯=1∶2為洗脫劑進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，分離獲得一種具有殺蟲(chóng)活性的單體化合物，對(duì)其進(jìn)行波譜分析鑒定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 16.0處理藥效數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 丁香殺蟲(chóng)活性部位的確定

丁香不同極性溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇)提取液對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的殺滅作用見(jiàn)表1。由表1可知，各提取液在所測(cè)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)均具有一定的殺滅作用，且隨著溶劑極性的增大其殺蟲(chóng)效果逐漸降低。而殺蟲(chóng)效果最好的為石油醚提取物，其質(zhì)量濃度為50.0 mg/L時(shí),在4 h即可殺滅100%幼蟲(chóng)，而甲醇的殺蟲(chóng)效果最差，其質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)殺滅率為30.0%。各提取物對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的殺滅活性的順序則依次是石油醚>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>甲醇提取物。

丁香不同極性溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇)提取液對(duì)多子小瓜蟲(chóng)包囊的殺滅作用見(jiàn)表2。由表2可知，各提取液對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的包囊均具有殺滅或抑制作用，且隨著溶劑極性的增大其殺蟲(chóng)效果逐漸降低。而殺蟲(chóng)效果最好的為石油醚提取物，其質(zhì)量濃度為80.0 mg/L時(shí)可100%殺滅包囊，而甲醇提取物的效果最差，其質(zhì)量濃度為80.0 mg/L時(shí)包囊的死亡率為30%。各提取物對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的殺滅活性的順序則依次是石油醚>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>甲醇提取物。

通過(guò)上述試驗(yàn)，確定丁香殺多子小瓜蟲(chóng)的活性部位為丁香的石油醚提取部位，對(duì)該部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

圖1 丁香4種不同極性溶劑提取物對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的殺滅作用(4 h)注：PE-E：石油醚提取物；CL-E：氯仿提取物；EA-E：乙酸乙酯提取物；ME-E：甲醇提取物.

質(zhì)量濃度/mg·L-1死亡率/%孵化蟲(chóng)數(shù)/個(gè)·包囊-1質(zhì)量濃度/mg·L-1死亡率/%孵化蟲(chóng)數(shù)/個(gè)·包囊-100.0±0.0a656.7±45.2a00.0±0.0a656.7±45.2a石油醚提取物20.026.7±3.3b684.3±55.7a氯仿提取物20.00.0±0.0a666.2±63.2a40.056.7±6.7c617.1±33.5a40.013.3±6.7b638.6±39.3a60.083.3±3.3d205.3±38.5b60.033.3±3.3d543.6±35.0b80.0100±0.00e0.00±0.00c80.043.3±6.7e341.5±22.8c乙酸乙酯提取物20.013.3±3.3b661.1±55.5a甲醇提取物20.00.0±0.0a651.3±33.7a40.026.7±3.3c633.4±41.0a40.00.0±0.0a628.7±46.3a60.040.0±6.7d611.5±28.0a60.010.0±0.0b615.3±45.7a80.060.0±6.7e436.3±24.5a80.030.0±2.2c433.3±35.3b

注：字母表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05).

2.2 殺蟲(chóng)活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)丁香石油醚提取物進(jìn)行進(jìn)一步的提取分離后獲得一種對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)和包囊均具有較好殺滅作用的單體化合物，該化合物為黃色液體，有芳香氣味，溶于乙醇、乙醚、氯仿，極微溶于水。對(duì)該化合物進(jìn)行波譜分析：EI-MS m/z:165[M++1];1H-NMR (CDCl3 )δ 6.76 (1H, d,J = 8.0 Hz,H-6) ,6.74 (1H, dd,J= 8.02.0 Hz,H-5) ,6.70(1H, d,J= 2.0 Hz,H-3),5.92(1H,ddt,J= 16.0,10.0, 0.7, 0 Hz, H-8), 5.05(2H, m, H-9a,9b), 3.80 (3H,s,2-OCH),3.28 (2H,d,J=7.0 Hz,H-7);13C-NMR(CDCl3)δ 147.9(C-1), 148.9(C-2), 111.9(C-3), 133.1(C-4), 120.65(C-5), 112.3(C-6), 39.8(C-7), 137.4(C-8), 115.8(C-9), 56.2(2-OCH3)。上述圖譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定該化合物丁香酚。

2.3 丁香酚對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的殺滅作用

丁香酚對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的殺滅作用見(jiàn)圖2。由圖2可知，丁香酚對(duì)多子小瓜蟲(chóng)具有較強(qiáng)的殺滅作用，隨著質(zhì)量濃度的增加其殺滅作用逐漸增強(qiáng)。其15 min、1 h、2 h、3 h 和 4 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(95% 置信區(qū)間) 分別為6.21 (5.85～6.65) mg/L、3.50 (3.24～3.84) mg/L、2.90 (2.62～3.22) mg/L、2.33 (2.10～2.50) mg/L 和 2.15 (1.98～2.32) mg/L，其質(zhì)量濃度為3.5 mg/L時(shí)，對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的殺滅率為100%。

圖2 丁香酚對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的殺滅作用4 h

丁香酚對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的殺滅作用見(jiàn)表2。由表2可知，丁香酚作用多子小瓜蟲(chóng)包囊后，可顯著抑制包囊的分裂，其質(zhì)量濃度為16.0 mg/L時(shí)，包囊未分裂，沒(méi)有幼蟲(chóng)孵化，提示其可100%殺滅包囊。而8.0 mg/L和12.0 mg/L質(zhì)量濃度組均有幼蟲(chóng)浮出，但其蟲(chóng)體孵化數(shù)分別為(435.1±12.6)個(gè)/包囊和(222.5±26.5)個(gè)/包囊，均顯著低于對(duì)照組(598.5±38.0)個(gè)/包囊。

包囊抑制試驗(yàn)結(jié)果還顯示，丁香酚對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的包囊的結(jié)構(gòu)具有極大的破壞作用。16.0 mg/L試驗(yàn)組經(jīng)6 h作用后，多子小瓜蟲(chóng)的包囊結(jié)構(gòu)完全破壞，胞質(zhì)外流，細(xì)胞核不可見(jiàn)。而對(duì)照組包囊結(jié)構(gòu)完好，且分裂完全(圖3)。

表2 丁香酚對(duì)多子小瓜蟲(chóng)包囊的成活和孵化影響(6 h)

圖3 丁香酚作用多子小瓜蟲(chóng)包囊后的顯微結(jié)構(gòu)a：丁香酚作用6 h后；b：正常分裂包囊.40×.

3 討 論

3.1 丁香的殺小瓜蟲(chóng)活性部位

天然植物因其源于自然，具有易降解、不易產(chǎn)生耐藥性、生物安全性高且結(jié)構(gòu)多樣性的優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受新藥研究者的重視，并逐漸成為研究的熱點(diǎn)。中藥活性部位篩選，多根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)“相似相溶”的原理，采用極性由弱漸強(qiáng)的不同溶劑進(jìn)行系統(tǒng)提取[12]，進(jìn)而在相同條件下進(jìn)行部位活性比較試驗(yàn)來(lái)判斷活性部位。本研究通過(guò)石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等4種溶劑對(duì)丁香進(jìn)行系統(tǒng)提取，發(fā)現(xiàn)其殺多子小瓜蟲(chóng)的高效活性成分主要存在于石油醚提取物中，同時(shí)本研究也主要針對(duì)石油醚提取部位進(jìn)行追蹤分離純化，并分離得到一種單體化合物，經(jīng)波譜分析鑒定為丁香酚，其對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的100%殺滅的質(zhì)量濃度為3.5 mg/L，其殺蟲(chóng)效果明顯優(yōu)于從博落回中分離到的二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿[10]，以及從五倍子中分離到五沒(méi)食子酰葡萄糖[13]，說(shuō)明丁香酚具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性和較廣的應(yīng)用的前景。同時(shí)，天然植物化學(xué)成分比較復(fù)雜，有些成分具有較高的活性成分，但是其在植物中的含量極低，故而可能在初篩中體現(xiàn)不出活性優(yōu)勢(shì)，因而本研究中乙酸乙酯提取物和氯仿提取物也表現(xiàn)一定的殺蟲(chóng)活性，可能存在的更好殺蟲(chóng)活性成分。

3.2 丁香酚殺蟲(chóng)作用及機(jī)理

丁香酚即4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，又稱子丁香酚，廣泛存在于丁香酚、肉桂葉油、樟腦油等芳香油中[14]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中丁香酚主要作為麻醉劑，在魚(yú)類親魚(yú)采卵、活魚(yú)運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)用[15-16]。而在醫(yī)藥上，具有抑菌、麻醉、解熱、抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)透皮吸收、驅(qū)蚊等多種藥理活性[17-19]，本研究發(fā)現(xiàn)丁香酚具有較強(qiáng)的殺多子小瓜蟲(chóng)的作用，這是首次發(fā)現(xiàn)該化合物具有殺水產(chǎn)動(dòng)物寄生蟲(chóng)功能。張杰等[20]在研究丁香酚對(duì)灰葡萄孢(Botrytiscinerea)孢子細(xì)胞膜透性中發(fā)現(xiàn)，在短時(shí)間(15 min)內(nèi)丁香酚即可破壞菌絲細(xì)胞膜的通透性，使菌絲細(xì)胞膜對(duì)K+的選擇通透性增加，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞破裂，進(jìn)而可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)的外流情況。Gill等[21]發(fā)現(xiàn)丁香酚能抑制李斯特菌(Listeriamonocytogenges)和沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)的三磷酸腺苷酶活性，進(jìn)而影響其能量代謝。Usta等[22]研究表明，丁香酚可抑制小鼠肝臟細(xì)胞膜上Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性，進(jìn)而影響K+運(yùn)輸，打破膜內(nèi)外濃度平衡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)外物質(zhì)交換失衡細(xì)胞損傷。而本研究丁香酚對(duì)包囊的研究結(jié)果也顯示，其可導(dǎo)致多子小瓜蟲(chóng)包囊的破裂，其作用機(jī)理也可能是改變了包膜上通透性或某些物質(zhì)的運(yùn)輸進(jìn)而導(dǎo)致包膜破裂，但其具體的作用位點(diǎn)、作用模式和作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

筆者從丁香中提取到一種對(duì)多子小瓜蟲(chóng)具有較好殺滅作用的活性物質(zhì)丁香酚，從植物中提取丁香酚的提取率高，成本低，且該化合物結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單較易合成。因此，丁香酚有望成為一種高效、低毒、環(huán)保型的綠色水產(chǎn)動(dòng)物殺蟲(chóng)劑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。

[1] Dickerson H W, Dawe D L.IchthyophthiriusmultifiliisandCryptocaryonirritans(Phylum Ciliophora)[G]//Woo P T K. Fish Diseases and Disorders. Volume 1: Protozoan and Metazoan Infections. 2nd ed. Wallingford, UK:CAB International, 2006:116-153.

[2] 倪達(dá)書(shū)，李連祥.多子小瓜蟲(chóng)的形態(tài)、生活史及其防治方法和一新種的描述[J]. 水生生物學(xué)集刊，1960(2)：197-225.

[3] Wahli T, Schmitt M, Meier W. Evaluation of alternatives to malachite green oxalate as a therapeutant for Ichthyophthiriosis in rainbow-trout,Oncorhynchusmykiss[J]. J Appl Ichthyol, 1993, 9(7):237-249.

[4] Rowland S J, Mifsud C, Nixon M, et al. Use of formalin and copper to control ichthyophthiriosis in the Australian freshwater fish silver perch (BidyanusbidyanusMitchell) [J].Aquacult Res, 2009, 40(5):44-54.

[5] Wohllebe S, Richter P, H?der D P. Chlorophyllin for the control ofIchthyophthiriusmultifiliis(Fouquet) [J].Parasitol Res, 2012, 111(9):729-733.

[6] Straus D L, Griffin B R. Efficacy of potassium permanganate in treating Ichthyophthiriasis in channel catfish[J]. Aquat Anim Health, 2002, 14(2):145-148.

[7] Shinn P, Camacho A P, Bron S M, et al. The anti-protozoal activity of bronopolonthe key life-stages ofIchthyophthiriusmultifiliisFouquet, 1876 (Cilio-phora)[J]. Vet Parasitol,2012, 186(3):229-236.

[8] Ling F, Wang J G, Wang G X, et al. Effect of potassium ferrate(Ⅵ) on survival and reproduction ofIchthyophthiriusmultifiliistomonts[J]. Parasitol Res, 2011, 109(2):1423-1428.

[9] Yao J Y, Shen J Y, Li X L, et al. Effect of sanguinarine from the leaves ofMacleayacordataagainstIchthyophthiriusmultifiliisin grass carp (Ctenopharyngodonidella)[J].Parasitolo Res,2010, 107(7):1035-1042.

[10] Yao J Y, Zhou Z M, Li X L, et al. Antiparasitic efficacy of dihydrosanguinarine and dihydrochelerythrine fromMacleayamicrocarpaagainstIchthyophthiriusmultifiliisin richadsin (Squaliobarbuscurriculus) [J]. Vet Parasitol, 2011, 183(1/2):8-13.

[11] 張永強(qiáng)，丁偉，趙志模，等.中藥植物丁香殺蟲(chóng)殺螨活性研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，26(4)：429-433.

[12] 宋曉平，王晶鈺，李引乾，等.地錦草體外抑菌有效部位的篩選試驗(yàn)[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，27(5) ：75-78.

[13] Zhang Q，Xu D H，Klesius P H． Evaluation of an antiparasitic compound extracted fromGallachinensisagainst fish parasiteIchthyophthiriusmultifiliis[J].Veterinary Parasitology，2013，198(1/2)：45-53．

[14] 劉長(zhǎng)琳，何力，陳四清.魚(yú)類麻醉研究綜述[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2007，34(5)：21-25.

[15] Keene J,Noakes D, Moccia R. The efficacy of clove oil as an anaesthetic for rainbow trout,Oncorhynchusmykiss(Walbaum)[J].Aqua Res,1998, 29(2):89-101.

[16] Weber R,Peleteiro J, Mart N L. The efficacy of 2-phenoxyethanol metomidate, clove oil and MS-222 as anaesthetic agents in the Senegalese sole[J].Aqua,2009,288(1):147-150.

[17] 樓興隆，李曉明，張鞍靈.丁香油抑菌成分研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(3)：91-93.

[18] 王樹(shù)桐，曹克強(qiáng)，張鳳巧.中藥丁香提取物對(duì)番茄灰霉病菌抑制作用及生防效果[J].植物病理學(xué)報(bào)，2005，35(6)：91-94.

[19] Ghosh R, Nadmnty N, Fitzapatrick J E. Eugenol causes melanoma growth suppression through inhibition of E2f1 trascriptionl activity [J].J Boil Chem, 2005,280(7):5812-5819.

[20] 張杰，王春梅，程羅根，等. 丁香酚對(duì)灰葡萄孢的抑制作用研究[J].農(nóng)藥藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(1)：68-74.

[21] Gill A Q, Holley R A. Mechanisms of bactericidal action of cinnamaldehude againstListeriamonocytogenes and of Eugenol against monocytogenes andLactobacillyssakei[J].Appl Environ Microb, 2004, 70(10):5750-5755.

[22] Usta J, Kpeydiyyeh S, Bamabe P. Comparative study on the effect of cinnamon and clove extracts and their main components on different types of ATPases [J].Hum Exp Toxicol, 2003(22)：355-362.

IsolationofActiveCompoundsfromEugeniacaryophyllataagainstIchthyophthiriusmultifiliisinVitro

YAO Jiayun, XU Yang, YUAN Xuemei, LIN Lingyun, YIN Wenlin, PAN Xiaoyi, HAO Guijie, SHEN Jinyu

( Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Ministry of Agriculture， Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province，Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou 313001, China )

Ichthyophthiriusmultifiliisis a holotrichous protozoan that invades the gills and skin surfaces of fish and can cause morbidity and high mortality in most species of freshwater fish worldwide. The present study was undertaken to investigate the antiparasitic activity of crude extracts and pure compounds fromEugeniacaryophyllata. The driedE.caryophyllatawas extracted successively in a separating funnel with petroleum ether, ethyl acetate, chloroform and methanol, in which only the petroleum ether extract showed promising activity (100% effectiveness againstI.multifiliistheronts and encysted tomonts at the concentration of 50.0 mg/L and 80.0 mg/L respectively) and therefore, was fractionated on silica gel column chromatography in a bioactivity-guided isolation affording a compound showing potent activity. The structure of the compound was elucidated as clove oil by hydrogen and carbon-13nuclear magnetic resonance spectrum and electron ionization mass spectrometry. The in vitro tests revealed that clove oil was found to be 100% effective against encysted tomonts at the concentration of 16.0 mg/L. The results showed that clove oil has potent anti-parasitic efficacy with the 15 min-, 1 h-, 2 h-, 3 h- and 4 h-LC50(95% Confidence Intervals) of 6.21 (5.85—6.65) mg/L, 3.50 (3.24—3.84) mg/L, 2.90 (2.62—3.22) mg/L, 2.33 (2.10—2.50) mg/L and 2.15 (1.98—2.32) mg/L against theronts ofI.multifiliis, respectively. The findings provide important information for the potential application of clove oil in the therapy of serious infection caused byI.multifiliis.

clove oil;Ichthyophthiriusmultifilis; active site; bioactivity-guided isolation

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.011

S941.5

A

1003-1111(2016)06-0669-06

2015-12-28；

2016-03-08.

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31302211)；浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目 ( 2014C32055 ).

姚嘉赟(1980—)，男，副研究員，碩士；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治. E-mail:yaojiayun@126.com. 通訊作者：沈錦玉(1963—)，女，研究員，碩士；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害防治. E-mail:sjinyu@126.com.