鄒瀟瀟，劉鑫鑫，朱 軍，林 勇，黃惠琴，鮑時(shí)翔

( 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101 )

馬尾藻屬新變種
——擬披針葉馬尾藻潭門變種的形態(tài)鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

鄒瀟瀟，劉鑫鑫，朱 軍，林 勇，黃惠琴，鮑時(shí)翔

( 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101 )

在海南省瓊海市潭門鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)了一種未見報(bào)道的馬尾藻。形態(tài)鑒定結(jié)果顯示，該馬尾藻與擬披針葉馬尾藻的形態(tài)特征十分相似，但氣囊結(jié)構(gòu)有明顯差異，故將其定名為擬披針葉馬尾藻潭門變種。對該新變種的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列特征及其與馬尾藻屬其他物種的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，擬披針葉馬尾藻潭門變種隸屬于真馬尾藻亞屬，并與瓦氏馬尾藻和亨氏馬尾藻具有較近的親緣關(guān)系。

新變種；褐藻；馬尾藻；形態(tài)鑒定；系統(tǒng)進(jìn)化分析

馬尾藻(Sargassum)是褐藻門、馬尾藻科、馬尾藻屬的一類重要經(jīng)濟(jì)海藻。馬尾藻褐藻淀粉含量很高，是提取褐藻膠的重要工業(yè)原料[1]；馬尾藻還含有多種維生素和礦物質(zhì)元素，作為飼料添加劑喂養(yǎng)家禽、牲畜，既可提高飼料的利用效率，又能提高飼養(yǎng)動(dòng)物的免疫力[2]；馬尾藻的多種營養(yǎng)成分，如從其藻體中提取的多糖，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制癌細(xì)胞、抗菌抗病毒等生理活性，保健和藥用價(jià)值極高[3-6]，因此馬尾藻在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品及醫(yī)藥等方面都有著十分廣闊的開發(fā)與應(yīng)用前景。此外，馬尾藻還可有效吸收氮、磷等導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的有機(jī)元素以及海水中的重金屬離子，對改善水體環(huán)境和海洋生態(tài)修復(fù)具有重要意義[7-8]。近年來隨著人們對海洋環(huán)境修復(fù)的重視度增加，馬尾藻的生態(tài)應(yīng)用價(jià)值更加凸顯。

馬尾藻多數(shù)為暖水性海藻，廣泛分布于暖水和溫水海域的近岸低潮帶和潮下帶[9-10]。馬尾藻屬種類甚多, 目前有記錄的種、變種及變型達(dá)941個(gè)，其中已被證實(shí)的僅有353種[11]。我國已報(bào)道的馬尾藻有131種，主要分布于南海、黃海和東海；其中南海的熱帶馬尾藻資源繁多，共約124種，并且半數(shù)以上為我國所特有的種類[12-14]。

海南島位于熱帶北邊緣，其海域廣闊、氣候適宜，非常適于馬尾藻的生長，使得海南省的馬尾藻資源非常豐富，為沿海居民帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)利益。但由于目前馬尾藻的利用以采摘野生資源為主，對海南省馬尾藻資源的分布規(guī)律和多樣性研究很少。此外，隨著部分海域環(huán)境的不斷惡化，海南馬尾藻資源面臨著一定程度的威脅，資源保護(hù)成為一個(gè)刻不容緩的任務(wù)。因此，開展海南的馬尾藻資源的調(diào)查和分類研究，對深入了解和保護(hù)其物種多樣性，加快相關(guān)資源的開發(fā)和利用進(jìn)程具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究在海南省瓊海市潭門鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與已報(bào)道馬尾藻形態(tài)特征有差異的新變種，并對其ITS序列特征及與其他馬尾藻的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。研究結(jié)果不僅能豐富對海南馬尾藻物種多樣性的認(rèn)識，而且也可為馬尾藻資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

馬尾藻樣品BTM038采自海南省瓊海市潭門鎮(zhèn)海域，采集成熟的完整藻體，用滅菌海水反復(fù)沖洗，除去附著的泥沙、多毛類、甲殼類動(dòng)物及其他雜藻。將洗凈的馬尾藻分成兩份：一部分藻體完整的藻株于玻璃缸中暫養(yǎng)，以便后續(xù)的形態(tài)學(xué)鑒定；另一部分則選取適量新鮮幼嫩的藻葉，用吸水紙吸干表面水分后，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

以曾呈奎[9]制定的馬尾藻形態(tài)學(xué)分類原則為主要依據(jù)，對馬尾藻BTM038的主干、初生分枝和次生分枝的直徑、初生葉、次生葉的形狀和大小、氣囊、固著器和生殖托的形態(tài)以及是否具有毛窩等特征進(jìn)行分類鑒定。

1.3 ITS序列分析

1.3.1 基因組DNA提取

將馬尾藻藻體清洗干凈后，取約1.0 g馬尾藻葉片，用液氮研磨成粉狀后，采用改良的 CTAB 法提取基因組DNA[15]。

1.3.2 PCR擴(kuò)增與序列測定

將提取的馬尾藻基因組DNA質(zhì)量濃度調(diào)整到50 ng/μL后，作為PCR反應(yīng)的模板，參照Yoon等[16]的方法對其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：LB1(F):5′-CGCGAGTCATCAGCTCGCATT-3′；LB2(R): 5′-AGCTTCACTCGCCGTACTGG-3′,PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 6 min；94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，36 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)對其進(jìn)行回收，然后與pMD18-T載體(大連寶生物有限公司)在4 ℃條件下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸肝菌(Escherichiacoli)(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞后，隨機(jī)挑選3個(gè)陽性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

利用DNAman軟件對測序所得序列進(jìn)行拼接和校正，獲得馬尾藻樣品BTM038的ITS一致序列。將一致序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，并下載馬尾藻屬19個(gè)物種的ITS序列，利用Mega 6.0 軟件進(jìn)行多序列比對；以囊鏈藻(Myagropsismyagroides)的序列(AY150022.1)作為外群，采用鄰接法、最大似然法、最大簡約法等方法分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)為1000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾藻BTM038的形態(tài)學(xué)特征

馬尾藻BTM038形態(tài)描述和圖片分別見表1、圖1。

表1 馬尾藻BTM038主要部位的形態(tài)描述

圖1擬披針葉馬尾藻潭門變種主要部位的形態(tài)

a.藻體； b，c.藻葉；d.氣囊； e.生殖托.

2.2 馬尾藻BTM038與擬披針葉馬尾藻形態(tài)特征的比較

馬尾藻BTM038與文獻(xiàn)記錄中的擬披針葉馬尾藻(S.pseudolanceolatum)[9]具有很多相似的特征： ①初生分枝圓柱形，光滑；②藻葉披針形；③氣囊球形或卵圓形；④雌雄異株；⑤雌生殖托扁壓，扁平，頂部較寬，小刺集中于此，雄生殖托圓柱形，上部具幾個(gè)刺等。

但兩者在氣囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)上有明顯不同(圖2)。馬尾藻BTM038的氣囊主要特征為：呈卵圓形，邊緣有細(xì)邊包裹，頂部帶有與氣囊直徑長度相近的尖；囊柄葉狀，毛窩兩列，邊緣有鋸齒，比氣囊的長度略長。擬披針葉馬尾藻的氣囊形態(tài)為：成熟時(shí)球形，幼期卵圓形，頂端圓形，表面具有幾個(gè)毛窩，囊柄較短，圓柱形，表面光滑，氣囊頂部不具備與氣囊直徑長度相近的尖。由于馬尾藻BTM038與擬披針葉馬尾藻相比，只在氣囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)上具有明顯不同,而兩者其他部位的形態(tài)結(jié)構(gòu)非常相似，因此將馬尾藻BTM038暫時(shí)定名為擬披針葉馬尾藻潭門變種(S.pseudolanceolatumvar.tanmen)。

圖2 擬披針葉馬尾藻潭門變種與擬披針葉馬尾藻的氣囊結(jié)構(gòu)比較a. 擬披針葉馬尾藻的氣囊[9]；b. 擬披針葉馬尾藻潭門變種的氣囊.

2.3 ITS序列特征

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列拼接和校正，得到馬尾藻BTM038的ITS序列全長(GenBank登錄號：KP101265)，經(jīng)過與GenBank中發(fā)布的其他馬尾藻物種的ITS序列進(jìn)行比對后，確定ITS1和ITS2的序列范圍。結(jié)果表明，馬尾藻BTM038的ITS序列全長為1440 bp，其中ITS1的序列長度為856 bp，5.8S序列長度為150 bp，ITS2序列長度為434 bp。ITS1和ITS2的GC含量分別為59.3%和59.2%。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank下載馬尾藻屬19個(gè)物種的ITS序列，利用Mega 6.0 軟件將馬尾藻BTM038的ITS序列與這些參考序列進(jìn)行比對，并以囊鏈藻(M.myagroides)的ITS序列(AY150022)作為外群，分別采用鄰接法、最大似然法和最大簡約法等構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由于3種方法得到的聚類的結(jié)果基本一致，故僅展現(xiàn)最大似然法得到的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，馬尾藻屬物種的被分為2個(gè)大的分支：其中真馬尾藻亞屬(S．subgen．Sargassum)的物種聚為一支，反曲葉亞屬(S．subgen．Bactrophycus)的7個(gè)物種聚為另一支，且2個(gè)分支均具有較高的支持率。馬尾藻BTM038與瓦氏馬尾藻(S.vachellianum)和亨氏馬尾藻(S.henslowianum)位于真馬尾藻亞屬內(nèi)的一個(gè)獨(dú)立小分支，且具有很高的支持率，說明馬尾藻BTM038與這兩種馬尾藻具有更近的親緣關(guān)系，而與其他真馬尾藻亞屬物種具有明顯差異。

圖3 利用ITS序列對擬披針葉馬尾藻潭門變種的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討 論

3.1 馬尾藻屬的分類鑒定

馬尾藻屬是褐藻門中最為復(fù)雜的屬之一，該屬物種的分類鑒定至今已有190多年歷史。馬尾藻的分類主要基于形態(tài)特征進(jìn)行，自1820年瑞典學(xué)者C. Agardh 首次創(chuàng)立馬尾藻屬以來，已有大約1000多種馬尾藻被報(bào)道(包括同物異名)。但是由于馬尾藻形態(tài)可塑性較大，并且可隨時(shí)間、環(huán)境等因素的改變而變化，甚至有些種類在個(gè)體之間也有很大差異，進(jìn)一步增加了該屬物種分類鑒定工作的難度[17]。我國的馬尾藻資源雖然非常豐富，但是對南海熱帶馬尾藻的研究甚少，對其種類多樣性、生物學(xué)特性等方面的認(rèn)識都十分有限，導(dǎo)致優(yōu)良熱帶馬尾藻資源的養(yǎng)殖和利用一直處于落后狀態(tài)。因此，開展對海南的馬尾藻資源的調(diào)查和分類研究，對加快相關(guān)資源的開發(fā)和利用具有重要意義。

擬披針葉馬尾藻是曾呈奎等[9]于2000年在海南三亞市榆林大東海發(fā)現(xiàn)的一種我國特有馬尾藻種類。本研究在開展對海南馬尾藻資源調(diào)查與分類研究的過程中，在潭門鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)了一種未見報(bào)道的馬尾藻，雖然其形態(tài)特征與擬披針葉馬尾藻非常相似，但兩者的氣囊形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯不同，因而將該變(新)種暫時(shí)定名為擬披針葉馬尾藻潭門變種。

3.2 BTM038與其他馬尾藻物種的親緣關(guān)系

為進(jìn)一步研究擬披針葉馬尾藻潭門變種與其他馬尾藻之間的親緣關(guān)系，本研究對BTM038的ITS序列進(jìn)行了分析，借助目前已有的馬尾藻物種ITS序列信息，發(fā)現(xiàn)BTM038與真馬尾藻亞屬的瓦氏馬尾藻和亨氏馬尾藻的親緣關(guān)系較近，而與其他真馬尾藻亞屬的物種明顯不同。瓦氏馬尾藻是一種在我國分布范圍較廣的特有種類[18-19]，而亨氏馬尾藻是藻體大小變化較大的一個(gè)種[20]；在形態(tài)上，這兩種藻類具有一定的相似性，尤其是在營養(yǎng)體階段，兩者的藻葉和一般習(xí)性極易混淆[9]。本研究的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示瓦氏馬尾藻和亨氏馬尾藻首先聚在一起，也暗示了這兩者之間可能存在較近的親緣關(guān)系。由于目前數(shù)據(jù)庫中提供的馬尾藻物種序列信息非常有限，雖然BTM038在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與這兩種馬尾藻聚在一個(gè)小分支內(nèi)，但是在形態(tài)上與這兩者存在一定差異；然而數(shù)據(jù)庫中缺乏與其形態(tài)特征非常相似的擬披針葉馬尾藻的序列信息，目前尚無法確認(rèn)這兩者之間是否具有較近的親緣關(guān)系。因此，若要準(zhǔn)確判斷擬披針葉馬尾藻潭門變種的分類地位，還需進(jìn)行大量的馬尾藻資源調(diào)查研究及相關(guān)物種基因信息的采集與分析。

[1] 羅先群, 王新廣, 楊振斌. 馬尾藻的營養(yǎng)成分測定及多糖的提取 [J]. 化學(xué)與生物工程, 2007,24(4): 64-66.

[2] 胡庭俊, 劉姍姍, 韋現(xiàn)色, 等. 馬尾藻多糖納米脂質(zhì)體對雞生長發(fā)育及免疫功能的影響 [J]. 飼料工業(yè), 2012,33(3):32-35.

[3] 王博, 黃和, 熊皓平, 等. 硇洲馬尾藻的營養(yǎng)成分分析與評價(jià) [J]. 食品研究與開發(fā), 2010,31(10): 195-197.

[4] Svetlana E, Roza S, Sang-Min K, et al. Fucoidans from brown seaweedsSargassumhornery,Ecloniacava,Costariacostata: structural characteristics and anticancer activity [J]. Applied Biochemistry & Biotechnology, 2011,164(6):841-850.

[5] 蔡璐, 王維民, 諶素華, 等. 不同組分馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯對人肺癌細(xì)胞A549作用的研究 [J]. 食品工業(yè)科技, 2014,35(1):116-119.

[6] Sousa A P A D, Torres M R, Pessoa C, et al. In vivo growth-inhibition of Sarcoma 180 tumor by alginates from brown seaweedSargassumvulgare[J]. Carbohydrate Polymers, 2007,69(1):7-13.

[7] 文竹青, 高偉, 何少華. 藻類吸附法去除廢水中的重金屬 [J]. 江蘇環(huán)境科技, 2006,19(2):49-51.

[8] 張永亮, 張浩江, 謝水波, 等. 藻類吸附重金屬的研究進(jìn)展 [J]. 鈾礦冶, 2009,28(1):31-37.

[9] 曾呈奎. 中國海藻志 第三卷 褐藻門 第二冊 墨角藻目 [M]. 北京:科學(xué)出版社, 2000.

[10] 曾呈奎. 中國黃渤海海藻 [M]. 北京:科學(xué)出版社, 2009.

[11] Guiry M D, Guiry G M. AlgaeBase.[EB/OL].2016,[2016-02-12] http://www.algaebase.org.

[12] Shimabukuro H, Suzuki M, Hamaguchi M. A new record ofSargassumalternato-pinnatumYamada(Fucales, Phaeophyceae) from Taiwan [J]. Taiwania, 2012,57(57):71-76.

[13] 黃冰心, 丁蘭平, 譚華強(qiáng), 等. 我國沿海馬尾藻屬(Sargassum)的物種多樣性及其區(qū)系分布特征 [J]. 海洋與湖沼, 2013,44(1):69-76.

[14] 黃冰心, 丁蘭平, 欒日孝, 等. 中國海洋褐藻門新分類系統(tǒng) [J]. 廣西科學(xué), 2015,22(2):189-200.

[15] 姚雪. 滸苔種群世代研究與大型海洋藻類基因序列分析 [D].青島：中國海洋大學(xué), 2011.

[16] Yoon H S, Ju Y L, Boo S M, et al. Phylogeny of Alariaceae, Laminariaceae, and Lessoniaceae (Phaeophyceae) based on plastid-encoded RuBisCo spacer and nuclear-encoded ITS sequence comparisons [J]. Molecular Phylogenetics & Evolution, 2001,21(2):56-57.

[17] Mattio L, Payri C E. 190 years ofSargassumtaxonomy, facing the advent of DNA phylogenies [J]. Botanical Review, 2011,77(1):31-70.

[18] 畢燕會(huì), 楊旭, 周志剛. 不同地理種群瓦氏馬尾藻ITS序列特征及其系統(tǒng)進(jìn)化分析 [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2014,38(9):1335-1344.

[19] 張建偉, 劉媛媛, 吳海龍,等. 環(huán)境因子對瓦氏馬尾藻生長及光合作用的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2014,20(6):1227-1235.

[20] 孫立偉, 謝恩義, 曲元?jiǎng)P. 亨氏馬尾藻的有性生殖觀察[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2015, 11(1):62-67.

MorphologicalIdentificationandPhylogeneticAnalysisofBrownSeaweedSargassumpseudolanceolatumvar.tanmen,aNewVarietyinSargassumGenus

ZOU Xiaoxiao, LIU Xinxin, ZHU Jun，LIN Yong，HUANG Huiqin, BAO Shixiang

( Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science, Haikou 571101, China )

A previously unreportedSargassumspecies was identified in Tanmen, Qionghai city of Hainan province. Morphological identification revealed that most features of the unreportedSargassumspecies were very similar toS.pseudolanceolatum, except for the structures of vesicles, thus, it was namedS.pseudolanceolatumvar.tanmen. Further analysis of the sequence characteristics of internal transcribed space, and the genetic relationship betweenS.pseudolanceolatumvar.tanmenand otherSargassumspecies showed thatS.pseudolanceolatumvar.tanmenbelonged toS．subgen．Sargassum, and was closely related toS.vachellianumandS.henslowianum.

new variety; brown alga;Sargassum; morphological identification; phylogenetic analysis

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.013

S932.7

A

1003-1111(2016)06-0681-05

2016-03-01；

2016-04-29.

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(2014050402)；海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12PYY001SF08)；海南省科技興海專項(xiàng)(XH201408)；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20163119)；院本級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(ITBB2015RC07，1630052015038).

鄒瀟瀟(1983—)，女，助理研究員，博士；研究方向：藻類生物學(xué).E-mail：zouxiaoxiao@itbb.org.cn.通訊作者：鮑時(shí)翔(1966—)男，研究員，博士；研究方向：藻類生物學(xué).E-mail：baoshixiang@itbb.org.cn.