賴曉健，熊 靜，張 哲，李忠琴

( 1. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021； 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021； 3. 福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361000 )

多子小瓜蟲滋養(yǎng)體糖蛋白殘基的種類和分布研究

賴曉健1,2，熊 靜1,2，張 哲3，李忠琴1,2

( 1. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021； 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021； 3. 福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361000 )

應(yīng)用伴刀豆凝集素A、麥胚凝集素、大豆凝集素和荊豆凝集素Ⅰ，檢測寄生于金魚皮膚、鰓和鰭上的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體糖蛋白殘基的種類和分布。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴刀豆凝集素A和麥胚凝集素免疫陽性染色在金魚皮膚、鰓和鰭寄生的滋養(yǎng)體上均有分布，麥胚凝集素免疫陽性染色強于伴刀豆凝集素A，未見有大豆凝集素和荊豆凝集素Ⅰ免疫陽性染色。鰓上寄生的滋養(yǎng)體伴刀豆凝集素A免疫陽性染色最強，皮膚次之，鰭最弱。鰭上寄生的滋養(yǎng)體麥胚凝集素免疫陽性染色最強，皮膚次之，鰓最弱。研究結(jié)果表明，滋養(yǎng)體有單糖D-甘露糖和D-葡萄糖，以及氨基衍生物乙酰氨基葡萄糖。寄生于鰓上的滋養(yǎng)體D-甘露糖和D-葡萄糖可能較多，寄生在鰭上的滋養(yǎng)體乙酰氨基葡萄糖可能較多。

植物凝集素；多子小瓜蟲；糖基；金魚

多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)隸屬原生動物門、寡膜纖毛綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬。多子小瓜蟲的生活史分為滋養(yǎng)體、包囊體和掠食體3個階段。多子小瓜蟲能夠破壞宿主魚呼吸、排泄和滲透機能，導(dǎo)致魚體死亡[1-2]，從而減少魚的種群數(shù)量。多子小瓜蟲是一種世界性分布的淡水魚類專性寄生蟲，對宿主沒有嚴格的選擇性，大多數(shù)淡水魚類都受其危害，該病流行面廣，患病魚死亡率很高，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高、養(yǎng)殖密度的不斷加大，該問題日益突出，已造成極大的經(jīng)濟損失[3]。

已有的研究表明，魚類寄生蟲的外膜含有糖蛋白殘基，包括多子小瓜蟲[4]。這些糖類和寄生蟲的宿主識別和貼附宿主細胞有關(guān)，也能夠調(diào)控入侵寄生蟲的行為[5]。植物凝集素由于其特異性識別和結(jié)合糖基的基本功能，可應(yīng)用于抗植物病毒、動物病毒、真菌和昆蟲等[6]。外源植物凝集素能特異性識別魚類寄生蟲膜上的糖基，且由于糖結(jié)合域的保守性，植物凝集素一般只能結(jié)合一種單糖或寡聚糖[7]。有學(xué)者應(yīng)用外源植物凝集素封閉寄生蟲表面的糖基后，發(fā)現(xiàn)寄生蟲對魚類宿主細胞的黏附作用和入侵受到抑制[8-9]。本研究選用的伴刀豆凝集素A、麥胚凝集素、大豆凝集素和荊豆凝集素Ⅰ能夠與大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的寄生蟲糖基結(jié)合，應(yīng)用這4種植物凝集素可以查明多子小瓜蟲滋養(yǎng)體糖蛋白殘基的種類和分布[10]。多子小瓜蟲對宿主的識別、貼附和入侵以及宿主病理學(xué)過程中糖基和凝集素相互作用的研究可以對多子小瓜蟲病害的防治提供新思路，還可為病原寄生蟲抗原合成的特異阻斷劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

感染多子小瓜蟲的金魚(Carassiusauratus)購自水族店。將病魚投入含30 mg/L 間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽的麻醉液中。取受感染的金魚組織皮膚、鰓和鰭，用新配的4%多聚甲醛固定8～12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片6 μm，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑藥品

間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽購自美國Sigma公司，生物素化植物凝集素購自美國Sigma和Vector公司。特異結(jié)合糖類和工作濃度等見表1。糖類購自Acros和阿拉丁公司，鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶和DAB試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。其他化學(xué)試劑為國藥化學(xué)分析純。

表1 試驗使用的植物凝集素、來源物種、使用量、特異性結(jié)合糖類、封閉糖類及濃度

1.3 免疫組織化學(xué)試驗

切片脫蠟復(fù)水后, 按常規(guī)方法進行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。滴加新鮮配制的1%H2O2，室溫孵育20 min。蒸餾水浸洗，TTBS緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.2，含0.05%Tween20)浸泡5 min。一抗采用生物素化凝集素20 ℃孵育1 h。使用生物素化凝集素前，先將生物素化凝集素和與之特異性結(jié)合的糖類在20 ℃中孵育1 h，以去除非特異性結(jié)合的干擾。TTBS浸洗3次×5 min后滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶，20 ℃孵育30 min。TTBS浸洗3次×5 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色3～8 min，蒸餾水沖洗,蘇木精輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對照片采用相鄰組織切片，用磷酸鹽緩沖液代替凝集素進行孵育，進行上述免疫組織化學(xué)反應(yīng)程序。

2 結(jié) 果

2.1 多子小瓜蟲的感染部位

多子小瓜蟲感染的金魚體表，皮膚和鰭均可見“白點”。揭開病魚鰓蓋，也見鰓絲上有“白點”。寄生于金魚的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體直徑超過600 μm，明顯可見馬蹄形大核。取受感染金魚皮膚、鰓和鰭組織，進行切片觀察，多子小瓜蟲滋養(yǎng)體大核明顯，食物泡中有大量的魚體細胞。滋養(yǎng)體已侵入表皮層(圖1c)，表皮破裂、脫落，有的已進入真皮層，接近肌肉層(圖1a)，在鰓組織中多子小瓜蟲侵入鰓小片之間，破壞鰓絲上皮和鰓小片上皮，兩個鰓小片之間的上皮細胞幾乎完全脫落，部分鰓小片殘缺不全，斷裂、脫落，鰓絲和鰓小片結(jié)構(gòu)模糊(圖1b)。

圖1 感染多子小瓜蟲的金魚組織蘇木精·伊紅染色圖a，皮膚；b，鰓；c，鰭；m，肌肉；gl，鰓小片；e，表皮.箭形所示為多子小瓜蟲. 標尺：50 μm.

2.2 植物凝集素免疫陽性染色在多子小瓜蟲滋養(yǎng)體的分布

免疫組織化學(xué)試驗結(jié)果表明，陰性對照均未見免疫陽性染色(圖2,a1～c1)。滋養(yǎng)體上有伴刀豆凝集素A和麥胚凝集素免疫陽性染色分布，伴刀豆凝集素A免疫陽性染色主要集中在滋養(yǎng)體的表面和細胞核周圍(圖2,a2～c2)，麥胚凝集素免疫陽性染色在滋養(yǎng)體的表面、細胞核周圍和細胞質(zhì)內(nèi)均有分布(圖2,a3～c3)，麥胚凝集素免疫陽性染色強于伴刀豆凝集素A。滋養(yǎng)體上均未見大豆凝集素和荊豆凝集素Ⅰ免疫陽性染色(圖2, a4～c5)。

在伴刀豆凝集素A免疫組織化學(xué)染色中，鰓上寄生的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體免疫陽性染色最強，皮膚次之，鰭最弱；而在麥胚凝集素免疫組織化學(xué)染色中，鰭上寄生的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體免疫陽性染色最強，皮膚次之，鰓最弱。

圖2 伴刀豆凝集素A，麥胚凝集素，大豆凝集素和荊豆凝集素I免疫染色圖縱向：1，陰性對照；2，伴刀豆凝集素A免疫染色；3，麥胚凝集素免疫染色；4，大豆凝集素免疫染色；5，荊豆凝集素Ⅰ免疫染色.橫向：a，皮膚；b，鰓；c，鰭.箭形所示為免疫陽性染色位點. 標尺:20 μm.

3 討 論

本試驗發(fā)現(xiàn)，伴刀豆凝集素A和麥胚凝集素能夠與寄生在魚體的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體表面結(jié)合。結(jié)果表明，滋養(yǎng)體表面有單糖D-甘露糖和D-葡萄糖，氨基衍生物乙酰氨基葡萄糖。Xu等[4]對多子小瓜蟲掠食體與植物凝集素的結(jié)合試驗表明，質(zhì)量濃度為50 μg/mL的小扁豆凝集素、大豆凝集素、荊豆凝集素Ⅰ和麥胚凝集素能夠與50%以上的掠食體結(jié)合。此結(jié)果提示掠食體表面有，單糖D-半乳糖、L-巖藻糖、D-甘露糖和D-葡萄糖；氨基衍生物乙酰氨基半乳糖和乙酰氨基葡萄糖。本研究發(fā)現(xiàn)的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體與Xu等[4]發(fā)現(xiàn)的掠食體表面糖基種類有差異，其表面不同的糖基組成可能對滋養(yǎng)體和掠食體完成不同的生理功能起著不同的作用。伴刀豆凝集素A和麥胚凝集素分布不同，表明不同部位滋養(yǎng)體表面糖基可能存在差異。寄生于鰓上的滋養(yǎng)體表面D-甘露糖、D-葡萄糖較多，而寄生于鰭上的滋養(yǎng)體表面乙酰氨基葡萄糖可能較多。不同糖基對多子小瓜蟲的寄生可能起不同的作用。

已有的研究表明，很多魚類寄生蟲的外膜含有糖基，如多子小瓜蟲掠食體[4]，隱鞭蟲屬(Cryptobia)[11]，侵襲內(nèi)阿米巴(Entamoebainvadens)[12]，香魚微孢子蟲(Glugeaplecoglossi)[9]，利什曼原蟲屬(Leishmania)[13]和球孢蟲屬(Sphaerospora)[14]種類。本研究發(fā)現(xiàn)的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體膜上有與外源植物凝集素特異性結(jié)合的糖基分布的現(xiàn)象，亦在兩種魚類腸道寄生蟲中發(fā)現(xiàn)。伴刀豆凝集素A能夠識別黏孢子蟲(Enteromyxumscophthalmi)膜上的葡萄糖—甘露糖；大豆凝集素，西非單豆葉凝集素Ⅰ，麥胚凝集素以及荊豆凝集素能夠識別N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基半乳糖和α-D-半乳糖[15]。而伴刀豆凝集素A和荊豆凝集素Ⅰ能夠分別識別金頭鯛(Sparusaurata)上李氏腸黏蟲(E.leei)膜上的葡萄糖—甘露糖和海藻糖[7]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，除在滋養(yǎng)體表面，滋養(yǎng)體的細胞質(zhì)和細胞核周圍也有免疫陽性染色，表明有糖基的分布。在寄生的黏孢子蟲和李氏腸黏蟲蟲體內(nèi)的孢子中也發(fā)現(xiàn)有植物凝集素的免疫陽性染色[7,15]。據(jù)此推測，可能由于寄生在魚體的滋養(yǎng)體體內(nèi)已經(jīng)合成相關(guān)的糖蛋白，為后面的包囊體生活史階段做好準備。

體外試驗已表明，多子小瓜蟲掠食體對宿主血清和黏液的成分具有選擇性，其中掠食體很可能首先通過打開宿主的黏液細胞而進入黏液細胞豐富的皮層[16]，而血清能夠吸引掠食體對宿主的穿透行為[17]。寄生蟲外膜糖蛋白的糖基很可能參與了寄生蟲的宿主識別和貼附作用[5]，所以這些寄生蟲的糖基對于宿主魚類來說是重要的抗原[18]，用外源植物凝集素封閉寄生蟲表面的糖基后，發(fā)現(xiàn)一些寄生蟲對魚類宿主細胞的黏附作用和入侵受到抑制[8-9,19]，大豆凝集素等植物凝集素能夠抑制多子小瓜蟲掠食體的運動和掠食體向滋養(yǎng)體的發(fā)育[4]。所以利用寄生蟲的糖基與凝集素特異性結(jié)合的特點研制出特異性封閉寄生蟲糖基或抑制其合成的藥物有很大的應(yīng)用前景[20]。這個想法在人類醫(yī)學(xué)上已有成功實現(xiàn)的例子。Mahalingam等[21]人工合成了一種外源性凝集素，這種凝集素能夠與人類免疫缺陷病毒包膜上的糖結(jié)合，阻止人類免疫缺陷病毒進入宿主細胞，從而阻止該病毒的感染。本研究應(yīng)用外源性的植物凝集素發(fā)現(xiàn)了滋養(yǎng)體糖蛋白殘基，可為人工合成能夠與滋養(yǎng)體糖基特異性結(jié)合的外源性凝集素的研發(fā)提供理論依據(jù)。

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DetectionofCarbohydrateTerminalsinParasiteIchthyophthiriusmultifiliisTrophont

LAI Xiaojian1,2, XIONG Jing1,2, ZHANG Zhe3, LI Zhongqin1,2

( 1.College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of Modern Eel Technical Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, China; 3. Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361000, China )

In the present study, parasiteIchthyophthiriusmultifiliisinvaded into skin, gill and fin of gold fish (Crassiusauratus) was sampled, and the special binding sites of the parasitic trophont′s carbohydrate residues were pinpointed using plant lectins Con A, WGA, SBA and UEA-Ⅰ. The results showed Con A and WGA immunostainings were observed in the parasite trophonts, and Con A immunostaining was stronger than WGA. SBA and UEA-Ⅰ immunostainings were not found in the tissues. Trophonts in the gill showed stronger Con A immunostaining than those in the skin and fin. The trophonts in the fin showed stronger WGA immunostaining than those in the skin and gill. There were mannose/glucose residues and also N-acetylglucosamine residues in the trophonts. It is inferred that trophonts in the gill had more mannose/glucose residues than those in the skin and fin, and trophont in the fin had more N-acetylglucosamine residues than those in the skin and gill.

plant lectin;Ichthyophthiriusmultifiliis; carbohydrate residue;Carassiusauratus

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.019

S941.5

A

1003-1111(2016)06-0713-05

2015-11-09；

2016-03-11.

鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心開放基金資助項目(RE201308)；福建省自然科學(xué)基金資助項目(2013J05052)；福建省科技廳重點項目(2013Y0089)；廈門市科技局項目(3502Z20133015)；集美大學(xué)科研啟動金資助項目(ZQ2012001)．

賴曉健(1984—)，男，助理研究員，博士；研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖與病害防治．E-mail: laixj@jmu.edu.cn．通訊作者：熊靜(1979—)，女，助理研究員，博士；研究方向：水產(chǎn)動物免疫與病害防治．E-mail: xiongjing@jmu.edu.cn．