王曉龍， 佟長青， 李 偉

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023)

Note: * stands for significant difference at 0.05 level between body and head,tail.Sample quality is 20 g.

?

間接酶聯(lián)免疫吸附法測定大鯢凝集素

王曉龍， 佟長青， 李 偉*

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023)

[目的]建立基于大鯢凝集素多克隆抗體酶聯(lián)免疫定量分析的方法。[方法]以大鯢凝集素為抗原，免疫新西蘭白兔獲得多克隆抗體，建立間接非競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，并對該方法的精密度及準(zhǔn)確度進(jìn)行了測試。[結(jié)果]獲得的抗血清效價為1∶16 000，多克隆抗體血清的最佳稀釋度為1∶3 000，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗最佳稀釋度為1∶30 000，抗原濃度在31.25～1 000.00 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，板內(nèi)及板間變異系數(shù)范圍分別為2.50%～9.88%和2.69%～11.59%，回收率為91.5%～109.5%。分布結(jié)果顯示，大鯢凝集素在軀干部肌肉組織中的含量較高。[結(jié)論]成功建立了大鯢凝集素間接非競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，該方法靈敏度高，重復(fù)性好，可用于實(shí)際檢測大鯢肌肉組織中的凝集素含量。

大鯢；凝集素；酶聯(lián)免疫；多克隆抗體

大鯢(Andriasdavidianus)俗稱“娃娃魚”，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動物，也是國家二級保護(hù)動物，主要分布于我國的長江、黃河、珠江中上游支流的山澗溪流[1]。經(jīng)人工養(yǎng)殖的子二代大鯢在醫(yī)藥保健、美食及觀賞等方面都具有非常高的開發(fā)應(yīng)用前景[2]。經(jīng)過30余年的發(fā)展，我國大鯢養(yǎng)殖已積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，但對于大鯢病害的發(fā)生及大鯢自身免疫系統(tǒng)的研究相對滯后[3]。大鯢在生長過程中出現(xiàn)腹脹、腐皮病、爛尾病和皮膚潰爛等與自身免疫功能下降相關(guān)的疾病給大鯢養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。因此，對于大鯢免疫系統(tǒng)中免疫因子的表達(dá)水平與大鯢健康狀況的研究顯得尤為重要。

凝集素作為天然免疫因子中重要的一環(huán)，在生物體微生物感染、病原識別、調(diào)理、吞噬，機(jī)體防御等方面具有極為重要的作用[7-9]，其含量與生物體自身的健康狀態(tài)密切相關(guān)。生物體受到外來致病微生物的入侵時，機(jī)體啟動免疫應(yīng)答，第1步是病原與宿主免疫因子間的識別，脊椎動物的凝集素途徑是補(bǔ)體激活途徑中重要的一部分[10]。已有研究表明，生物體在大量細(xì)菌感染后的急性應(yīng)答期，巨噬細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6，進(jìn)而促使肝細(xì)胞合成包括甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)，此時血清中MBL含量明顯增加，因此MBL在血清中含量的高低將直接影響生物體免疫防御功能的發(fā)揮，可以作為衡量生物體健康狀況的一個有效指標(biāo)[11]。因此，筆者利用大鯢凝集素(ADL)免疫新西蘭白兔，制備大鯢凝集素蛋白多克隆抗血清，建立大鯢凝集素間接ELISA檢測方法，證實(shí)該ELISA方法的可行性，并對大鯢樣本中的頭部、軀干和尾部肌肉組織中的ADL含量進(jìn)行測定，了解其在大鯢體內(nèi)3個不同部位表達(dá)的情況，為后續(xù)進(jìn)一步研究ADL的表達(dá)水平與大鯢患病狀況之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鯢凝集素ADL參照Qu等[12]的方法制備。主要試劑：弗氏完全佐劑及弗式不完全佐劑,Sigma;牛血清白蛋白及卵清蛋白,Solarbio;BCA法蛋白定量試劑盒,青島捷世康生物科技有限公司;封閉液和TMB顯色液，北京梅科萬德生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，北京康成生物工程公司。包被液：0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；稀釋液：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液；洗滌液：含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；終止液：2 mol/L的H2SO4溶液。

1.2 方法

1.2.1 兔多克隆血清的制備。該試驗(yàn)以雄性新西蘭大白兔為免疫對象，月齡3個月，體重1.5 kg，購于大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。免疫前于耳緣靜脈采血制備免疫前血清，即陰性血清。取0.5 mg大鯢凝集素溶于0.5 mL生理鹽水，加入等體積弗氏完全佐劑后充分混合，制成0.5 mg/mL的抗原乳化液，待乳化完全后于兔頸背部皮下多點(diǎn)注射，此后將弗氏完全佐劑更換為弗氏不完全佐劑，以同樣劑量及免疫方式每14 d免疫1次，共免疫4次，末次免疫后7 d大量采血，采集到的血液于4 ℃冰箱中過夜，3 000 r/min離心15 min，取上清，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.2 凝集素ADL多克隆抗體效價測定。用包被液將凝集素ADL按100 μL/孔，4 ℃過夜包被酶標(biāo)板；包被結(jié)束后洗滌液洗板3次，200 μL/孔；加入封閉液封閉酶標(biāo)板，200 μl/孔，37 ℃封閉1 h；封閉結(jié)束后洗滌液洗板3次，將兔多克隆血清從1∶100倍開始倍比稀釋，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)1 h，同時做陰性對照；反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)洗板3次，加入1∶20 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光反應(yīng)20 min；最后按50 μL/孔加入終止液，在波長450 nm下使用酶標(biāo)儀讀取吸光度。以陽性血清/陰性對照(P/N)≤2.1，且OD450≥0.1，此時的抗體稀釋倍數(shù)即是該抗血清的效價。

1.2.3 方陣法測定抗原抗體的最適稀釋度。為了獲得最佳的測定條件及節(jié)約試劑用量，該試驗(yàn)采用方陣法對ADL的包被量及血清多抗稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，橫列將凝集素抗原溶液用包被液從1∶1 600到1∶51 200倍比稀釋，稀釋成6個不同濃度的稀釋液，包被酶標(biāo)板；縱列將血清多抗按照1∶400倍到1∶12 800倍倍比稀釋，二抗用稀釋液按1∶30 000倍稀釋，進(jìn)行間接非競爭酶聯(lián)免疫檢測，

1.2.4 間接非競爭酶聯(lián)免疫程序。在酶標(biāo)板內(nèi)包被ADL，100 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板，4 ℃包被過夜；包被結(jié)束后倒去包被液，洗滌液洗板3次，200 μL/孔；加入封閉液封閉酶標(biāo)板，200 μL/孔，37 ℃封閉1 h；封閉結(jié)束后洗滌液洗板3次，加入1∶3 000倍稀釋的抗血清，37 ℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)洗板3次，加入1∶30 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光反應(yīng)20 min；最后按50 μl/孔加入終止液，在波長450 nm下使用酶標(biāo)儀讀取OD值。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)。該試驗(yàn)以板內(nèi)差異和板間差異來確定該方法的重復(fù)性。在線性范圍內(nèi)取7個濃度(1 000.000～15.625 ng/mL)的抗原溶液包被酶標(biāo)板，每板設(shè)置6個反應(yīng)孔，按步驟“1.2.2”進(jìn)行ELISA測定，由OD450 nm值計(jì)算出OD平均值及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，由公式CV%=(SD/OD平均值)×100%計(jì)算板內(nèi)變異系數(shù)，用同樣的方法在另外3塊酶標(biāo)板上重復(fù)試驗(yàn)，根據(jù)OD450 nm計(jì)算板間變異系數(shù)。

1.2.6 添加回收率測定。在PBS緩沖液中分別加入 1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50 μg/mL ADL，用PBS緩沖液適當(dāng)稀釋后每個樣品取6個平行， ELISA法測定其回收量，計(jì)算回收率。

1.2.7 大鯢樣本ADL測定。分別取9只大鯢，編號1～9，取大鯢頭部、軀干、尾部肌肉組織，均質(zhì)后取20 g加生理鹽水100 mL，4 ℃下抽提過夜，抽提液9 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定。取1 mL上清液稀釋10倍后使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量；將上清液稀釋1 000倍后取100 μL包被酶標(biāo)板，進(jìn)行ELISA測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ADL濃度，最終得出樣品中ADL的質(zhì)量。每個樣本重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝集素ADL多克隆抗體效價 以純化好的凝集素為免疫原，0.5 mg/只頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭兔，于末次免疫7 d后大量采血，獲得抗血清。以ADL為包被抗原，采用間接ELISA法對抗血清效價進(jìn)行檢測，測得抗血清效價為1∶16 000。

2.2 抗原抗體最適稀釋度 適當(dāng)?shù)难逑♂尪饶軌蚪档脱逯械母蓴_物質(zhì)，增加方法的靈敏度，較高的抗原稀釋倍數(shù)可以節(jié)約試劑。從表1中可以看出，在抗原稀釋度為1∶6 400，抗血清稀釋倍數(shù)為1∶3 200時，吸光度值為1.161，符合棋盤滴定法中吸光度值在1附近為宜的原則，因此可以確定為最佳的稀釋度。

表1 大鯢凝集素ADL ELISA檢測中抗血清與包被抗原的稀釋度

2.3 間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將配制的400 μg/mL ADL抗原溶液，從1∶400倍比稀釋至1∶25 600，包被96孔酶標(biāo)板，按步驟“1.2.2”的酶聯(lián)免疫程序進(jìn)行試驗(yàn)，以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值OD450為縱坐標(biāo)，得到間接非競爭酶聯(lián)免疫測凝集素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可見，在31.25～1 000.00 ng/mL蛋白濃度范圍內(nèi)，凝集素濃度的對數(shù)值和吸光度之間具有較好的線性關(guān)系。

2.4 重復(fù)性 從表2可以看出，該方法重復(fù)性較好，板內(nèi)變異系數(shù)為0.92%～9.68%，板間變異系數(shù)為1.57%～12.35%，均小于15.00%，達(dá)到ELISA測定方法的質(zhì)量控制要求。

2.5 回收率 由表3可見，在6次試驗(yàn)中，5個添加量的回收率誤差均在15%的范圍內(nèi)，滿足了ELISA方法的測定要求。

圖1 間接非競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Indirect non-competitive ELISA standard curve

2.6 大鯢樣本測定結(jié)果 ELISA測定的結(jié)果顯示(表4)，大鯢凝集素在大鯢的頭部、軀干及尾部的肌肉組織中均有分布，在軀干部的含量相對較高，不同大鯢之間相同部位的ADL含量分布范圍較小。方法檢測到ADL占抽提總蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為頭部(2.12±0.11)%，軀干(2.09±0.12)%，尾部(2.05±0.08)%，總體相差不大；9只大鯢不同身體部位中ADL質(zhì)量分布范圍分別為頭部(19.51±0.81)～(22.86±0.84) mg，軀干(24.24±0.57)～(27.72±0.58) mg，尾部(17.33±1.30)～(19.86±0.51)mg(取不同部位樣品質(zhì)量均為20 g)，含量為軀干>頭部>尾部，頭部和尾部中ADL含量不具有差異性(P>0.05)，在軀干部的表達(dá)含量明顯高于頭部及尾部，具有顯著性差異(P<0.05)。該結(jié)果可

表2 ELISA檢測ADL含量板內(nèi)及板間變異系數(shù)(n=6)

表3 回收率測定結(jié)果(n=6)

能是因?yàn)閮蓷珓游镘|干部占整體的比例較大，擁有更大的體表面積，且內(nèi)部包含胸腺、骨髓、脾臟等其他主要免疫器官以及分布于相關(guān)組織器官的淋巴組織，因此在相近的肌肉組織中會有較高的含量。周旋等[14]在研究了兩棲動物中的東北林蛙在受到彩虹病毒脅迫下，參與先天免疫的模式識別分子NF-κB和I-κB在其皮膚、肝臟和脾臟中的表達(dá)情況，結(jié)果表明東北林蛙的皮膚能夠分泌出抑制微生物活性的物質(zhì)，成為抵抗病原微生物入侵的第1層屏障，并在病毒刺激的后期，該模式識別分子NF-κB在皮膚和肝臟中的表達(dá)上調(diào)，表明在兩棲動物的先天性免疫中，皮膚中的模式識別分子會在致病微生物感染的初期起到抵制作用，而在刺激的后期，脾臟則擔(dān)負(fù)起了主要的免疫調(diào)控作用。凝集素同樣作為先天性免疫中的一種重要模式識別受體，在機(jī)體生長發(fā)育的過程中可能也會起到相似的免疫調(diào)節(jié)作用。

Table 4 The distribution of ADL in the head,trunk and tail ofAndriasdavidianus

mg

注：表中“*”表示軀干部與頭部、尾部相比，在0.05水平差異顯著，取樣品質(zhì)量均為20 g。

Note: * stands for significant difference at 0.05 level between body and head,tail.Sample quality is 20 g.

3 結(jié)論與討論

目前，大鯢已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人工養(yǎng)殖，且養(yǎng)殖規(guī)模也在逐年擴(kuò)大，一些養(yǎng)殖企業(yè)對于大鯢在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的病害問題，也只是采用改善機(jī)體營養(yǎng)和養(yǎng)殖條件的方式去應(yīng)對，并未對大鯢自身免疫分子進(jìn)行深入的研究，無法科學(xué)有效地避免大鯢非正常死亡，因此最終會造成經(jīng)濟(jì)損失。

凝集素作為一大類對特定多糖具有親和力的多價糖蛋白，廣泛分布于皮膚黏液、血液及組織器官中，在抵御致病微生物入侵的第1階段即“自己”和“非己”識別階段發(fā)揮重要作用。因此從大鯢自身免疫系統(tǒng)著手，對其中具有的免疫活性物質(zhì)進(jìn)行研究，開發(fā)基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的大鯢凝集素檢測試劑盒，對于研究大鯢凝集素在其體內(nèi)不同組織中的分布特征及表達(dá)水平與大鯢健康狀況之間的關(guān)系，將具有一定的實(shí)際意義。該試驗(yàn)使用從大鯢體表黏液中分離純化的大鯢凝集素(ADL)作為為完全抗原，免疫新西蘭白兔，成功制備出高效價的多克隆抗體，確定了抗原抗體的最佳稀釋倍數(shù)，建立了檢測ADL含量的間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對該方法的重復(fù)性及添加回收率作出評價，證實(shí)該方法的可行性，最后通過建立的ELISA檢測方法對大鯢樣本進(jìn)行檢測，確定其在生物體內(nèi)不同部位的分布。在今后的研究中，人們可結(jié)合單克隆抗體制備及免疫組化技術(shù)，擴(kuò)大檢測樣本的選取范圍，如血液樣本及更容易采集到的體表黏液等，確定健康大鯢中ADL的分布范圍，對低于正常值下限的大鯢及時采用合理的治療手段，降低大鯢的非正常原因死亡數(shù)量，減少養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。參考文獻(xiàn)

[1] 李莉,王錫昌,劉源.中國養(yǎng)殖大鯢的食用、藥用價值及其開發(fā)利用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2012，33(9):454-458.

[2] 熊鏵龍,姚俊杰,蔣左玉,等.貴州人工養(yǎng)殖子二代大鯢骨骼、肌肉中10種元素的測定[J].食品工業(yè)科技,2014，35(18)：71-73，79.

[3] 楊星,劉文枝,肖漢兵,等.嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫后大鯢外周血免疫指標(biāo)的變化[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2014，21(3):621-628.

[3] 于喆，江輝，鐘蕾，等.大鯢細(xì)菌性感染綜合征的病原分離與藥敏試驗(yàn)分析[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2012,35(6):74-79.

[4] 高正勇,曾令兵,孟彥,等.患病大鯢中弗氏檸檬酸桿菌的分離與鑒定 [J].微生物學(xué)報,2012,52(2):169-176.

[5] 賀路,劉鑒毅.大鯢的病害及其防治[J].水利漁業(yè),1999,19(1):31-32.

[6] 耿毅,汪開毓,李成偉,等.蛙病毒感染致養(yǎng)殖大鯢大規(guī)模死亡的電鏡觀察及PCR檢測[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010，40(8):817-821.

[7] 王春玲,夏焱,張士嬌,等.家蠅蛹甘露糖結(jié)合凝集素的結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)節(jié)作用[J].生物工程學(xué)報,2013，29(5):601-611.

[8] 陳政良.C型凝集素的免疫功能[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,1997，13(S2)：34-37.

[9] 鄭珍,薛壯,逄越,等.Galectins/intelectins凝集素家族——固有免疫中重要的模式識別分子[J].免疫學(xué)雜志,2014，30(1):75-78.

[10] 陳政良.補(bǔ)體激活第三途徑——凝集素途徑[J].國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊),1999，21(5):295-298.

[11] 田群.甘露聚糖結(jié)合凝集素與疾病相關(guān)性研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012(24):272，276.

[12] QU M，TONG C Q，KONG L,et al.Purification of a secreted lectin from Andrias davidianus skin and its antibacterial activity[J].Comparative biochemistry and physiology part C: Toxicology & Pharmacology，2015,167：140-146.

[13] 林清華.免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].武漢：武漢大學(xué)出版社，1999：254-260.

[14] 周旋,肖向紅,張晶鈺，等.虹彩病毒脅迫下東北林蛙NF-κB和I-κB的差異表達(dá)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,41(10):108-111.

An Indirect Non-competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Determination ofAndriasdavidianusLectin

WANG Xiao-long,TONG Chang-qing,LI Wei*

(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian,Liaoning 116023)

[Objective] To prepare polyclonal antibody against the content of lectin in skin mucous ofAndriasdavidianusand develop an indirect non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).[Method]Andriasdavidianuslectin was used as complete antigen.The New Zealand white rabbits were immunized according to the immunization procedure.Finally through the optimization of coating amount of lectin and antibody dilution,an indirect non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay was developed.[Result] The titer of the antiserum determined by ELISA was up to 1∶16 000.Determined polyclonal antibody diluted was 1∶3 000.The best working dilution of horseradish peroxidase-conjugated affinipure goat anti rabbit IgG was 1∶30 000.The linear range of the method was 31.25-1 000.00 ng/mL (R2>0.99).The variation coefficients of intra-assay and inter-assay were 2.50%-9.88% and 2.69%-11.59%,respectively.Recoveries ranged from 91.5% to 109.5%.[Conclusion] A rapid,sensitive and repeatable indirect non-competitive ELISA detection method forAndriasdavidianuslectin allergens was established successfully.This method is suitable for qualitative determination ofAndriasdavidianuslectin.

Andriasdavidianus; Lectin; Enzyme-linked immunosorbent assay; Polyclonal antibody

國家自然基金項(xiàng)目(31571916)；大連海洋大學(xué)引進(jìn)人才及在職培養(yǎng)博士啟動項(xiàng)目(100914262)。

王曉龍(1989- )，男，甘肅白銀人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工與貯藏。*通訊作者，教授，博士，從事食品科學(xué)研究。

2016-09-30

S 966.6

A

0517-6611(2016)33-0074-03