?夏愛蓮，金晨鐘,2,3，胡一鴻,2,3，劉 宵，鄒婷婷，王 艷,2,3?

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；

2.湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；3.農(nóng)藥無害化應(yīng)用湖南省高校重點實驗室，湖南 婁底 417000）

草甘膦脅迫對馬唐抗氧化酶系及丙二醛含量的影響研究

夏愛蓮1，金晨鐘1,2,3，胡一鴻1,2,3，劉 宵1，鄒婷婷1，王 艷1,2,3

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；

2.湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；3.農(nóng)藥無害化應(yīng)用湖南省高校重點實驗室，湖南 婁底 417000）

研究了在不同濃度草甘膦脅迫下，馬唐（Digitaria sanguinalis L.）體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等3種抗氧化酶活性及其丙二醛（MDA）含量隨時間的變化情況。結(jié)果表明：馬唐在草甘膦脅迫初期，3種酶活性和MDA含量較對照值有所提高；草甘膦處理6 d后，各指標(biāo)均達到最高值；第9天后，各指標(biāo)開始下降；至第12天后，450、900和1 800 g/hm2草甘膦處理馬唐的SOD、POD、CAT活性及MDA含量均降至對照水平。這表明草甘膦對馬唐的傷害在經(jīng)過一定時間的生長發(fā)育后可恢復(fù)，說明馬唐對草甘膦較易產(chǎn)生抗藥性。

草甘膦；馬唐；抗氧化酶系統(tǒng)；丙二醛

全球廣泛分布的各種雜草已嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，極大危害了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展?；瘜W(xué)除草劑是防治雜草的主要方法，草甘膦理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有低毒、低殘留、高效、廣譜、滅生性等優(yōu)點，是目前全世界除草劑使用量最大的品種之一[1]。但隨著草甘膦用量持續(xù)增加，選擇壓也在增加，抗草甘膦雜草也日益增多，到目前為止已經(jīng)公布了28種雜草對草甘膦產(chǎn)生抗性[2]，抗草甘膦雜草問題日益嚴(yán)重，急需解決。馬唐（Digitaria sanguinalis L.）屬禾本科一年生草本植物，廣布全國各地，是旱秋作物田地、果園、苗圃的惡性雜草，發(fā)生數(shù)量、分布范圍在旱地雜草中均居首位，以作物生長的前中期危害為主[3]。近年來，在中國南方地區(qū)，許多旱秋作物田地及果園等使用草甘膦頻繁，導(dǎo)致其對馬唐的防除效果變差，給果園和農(nóng)田管理帶來極大不便。

據(jù)已有研究表明，雜草對草甘膦的抗性機制至少有3種：靶標(biāo)酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的改變、除草劑在植物體內(nèi)的吸收和傳導(dǎo)以及除草劑代謝速率的改變[4-5]。除草劑對植物產(chǎn)生毒害的過程中往往會誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧等自由基，有研究表明：噴施樂果可促使菠菜葉片中POD、CAT活性增強以及MDA含量明顯增加[6]；不同時期草甘膦處理引起了銅綠微囊藻的氧化損傷，加藥組的MDA含量顯著增加[7]；不同濃度的草甘膦脅迫導(dǎo)致鐵皇冠葉片SOD、CAT、POD活性提高，MDA含量逐漸增加[8]。

據(jù)湖南地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣機構(gòu)和農(nóng)民反映，草甘膦在防除旱秋作物田地、田埂、果園的馬唐時用量加大、效果變差，但目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)馬唐對草甘膦抗性的研究報道。因此，試驗以馬唐的葉片為材料，從植物生理生化角度研究馬唐的抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)與馬唐抗藥性之間的關(guān)系，旨在為我國抗草甘膦雜草研究和馬唐等抗性雜草的防除提供理論依據(jù)，提高人們對抗藥性植物的認(rèn)識。

1　材料與方法

1.1試驗材料與儀器

供試馬唐種子于2015年9月在婁底市思塘村的彩色水泥廠對面菜地采集，種子經(jīng)自然風(fēng)干，3周后置于紙袋內(nèi)室溫存儲備用。實驗用土壤于湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院實驗樓下挖取，烘干后碾碎，與基質(zhì)按1∶1混勻，移至花盆備用；草甘膦異丙胺胺鹽（41%）購自于湖南婁底農(nóng)科所農(nóng)藥實驗廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器為：賽多利斯電子天平、754紫外-可見光分光光度計及Conviron探入式植物生長箱。

1.2試驗方法

1.2.1種子萌發(fā) 取若干馬唐種子置于培養(yǎng)皿中的濾紙上，加入適量蒸餾水浸泡24 h，去掉蒸餾水后加入適量52 g/L KNO3浸泡48 h，用蒸餾水洗凈后置入生長箱內(nèi)培養(yǎng)萌發(fā)（白天：溫度28℃，光照14.5 h，相對濕度65%；夜間：溫度24℃，光照9.5 h，相對濕度55%）。待發(fā)芽后，移入事先裝好土壤的花盆中。繼續(xù)放入生長箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2草甘膦處理 當(dāng)馬唐長至15～20葉期時，用手持壓縮噴霧器給馬唐均勻噴霧不同濃度的草甘膦，對水量為450 L/hm2。每個處理1桶，面積約0.2 m2，設(shè)置草甘膦為5個濃度梯度：有效成分分別為0、450、900（推薦劑量）、1 800和3 600 g/hm2。

1.2.3指標(biāo)測定及方法 在草甘膦處理第3、6、9和12天后的上午，取草甘膦處理的馬唐葉片于冰盒，迅速帶回實驗室，取0.1 g葉片，用0.8 mL PBS（0.2 mol/L，pH值7.8）研磨，定容到1 mL，在12 000 r/min的條件下離心15 min，所得上清液可用于SOD、POD、CAT活性、MDA含量的測定。

馬唐葉片SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法測定；CAT活性用分測定采用分光光度法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[9-10]。各指標(biāo)的測定重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計顯著性分析（ANOVA法）和作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1草甘膦脅迫對馬唐葉片SOD活性的影響

由圖1可知，隨著不同濃度草甘膦處理馬唐時間的延長，其馬唐葉片SOD活性呈先升高后降低的趨勢，且其SOD活性隨草甘膦劑量的增加而增加，均在第6天達到最高。草甘膦處理后第3、6和9天，除了0和450 g/hm2處理的SOD活性無顯著性差異外，其他各組均有顯著性差異；處理第12天，除了1 800和3 600 g/hm2處理SOD活性顯著高于對照外，其他各劑量之間無顯著性差異，且各濃度草甘膦處理的SOD活性均有所下降，尤其450和900 g/hm2處理的SOD活性基本恢復(fù)至對照水平。這可能是由于馬唐通過提高SOD活性來抵御草甘膦可能帶來的氧化損傷，到脅迫后期低濃度（450～900 g/hm2）草甘膦處理馬唐的SOD活性才恢復(fù)至對照水平。

圖1　草甘膦脅迫對馬唐葉片SOD活性的影響

2.2草甘膦脅迫對馬唐葉片POD活性的影響

由圖2可知，POD活性隨著草甘膦脅迫時間的延長和劑量的增加而增加，第6天達到峰值，然后POD活性開始呈現(xiàn)下降趨勢，在第3和6天，除了450 g/hm2處理外，其他各處理的POD活性均顯著高于對照，且在第6天各處理間有顯著性差異。在第12天，除了3 600 g/hm2處理的POD顯著高于其他各組和對照外，其他各劑量之間無顯著性差異，且450～1 800 g/hm2處理的POD活性恢復(fù)至對照水平，這說明低劑量（450～1 800 g/hm2）草甘膦脅迫馬唐的影響基本消除。

圖2　草甘膦脅迫對馬唐葉片POD活性的影響

2.3草甘膦脅迫對馬唐葉片CAT活性的影響

從圖3可知，馬唐葉片CAT活性隨草甘膦脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢。隨脅迫濃度升高而升高。均在草甘膦處理第6天達峰值。在整個實驗的過程中，1 800和3 600 g/hm2處理的CAT活性均顯著高于其它各處理，且在第6、9和12天他們之間CAT活性無顯著性差異，此時，0和450 g/hm2草甘膦處理的CAT活性也無顯著性差異；第12天，450和900 g/hm2處理的CAT活性降至接近對照水平，且他們均與對照無顯著性差異，這與本研究中SOD、POD活性的變化基本一致。

圖3　草甘膦脅迫對馬唐葉片CAT活性的影響

2.4草甘膦脅迫對馬唐葉片MDA含量的影響

如圖4所示，900～3 600 g/hm2草甘膦劑量處理的MDA含量隨脅迫時間的延長呈先增加后降低的趨勢，且均是第6天 MDA含量達到最大，然后緩慢下降，其中3 600 g/hm2草甘膦處理的MDA含量從實驗第6～12天均顯著高于其他各處理。這說明草甘膦濃度愈高脅迫導(dǎo)致馬唐體內(nèi)膜質(zhì)過氧化受損愈嚴(yán)重；草甘膦處理12 d，除3 600 g/hm2草甘膦外，其他各處理的MDA含量均降至對照水平，且他們之間與對照均無顯著性差異，這說明450～1 800 g/hm2草甘膦引起馬唐質(zhì)膜受損的情況基本消除，這與本研究中SOD、POD、CAT活性的變化基本一致。

圖4　草甘膦脅迫對馬唐葉片MDA含量的影響

3　結(jié)論與討論

植物在正常代謝中會產(chǎn)生O2-、·OH、H2O2等活性氧。通常情況下，SOD是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧（O2-）系統(tǒng)中的重要酶，對維持植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡起著重要的作用，從而使植物細(xì)胞免受傷害[11]。POD可有效地清除各種逆境脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物（H2O2），以降低其對植物自身的毒害，維持質(zhì)膜透性及自由基之間的動態(tài)平衡，保證植物進行正常生長代謝[12]。SOD活性的升高，導(dǎo)致葉片細(xì)胞內(nèi)積累了大量的H2O2，此時通過增加POD活性將H2O2進行分解，以提高其在逆境下的適應(yīng)能力。CAT與SOD、POD協(xié)同作用，能有效地清除體內(nèi)的活性氧，維持植物體活性氧代謝的平衡，保護細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)不受到傷害。

正常情況下，植物體活性氧的產(chǎn)生和清除兩者處于平衡狀態(tài)；但在逆境脅迫下，這種平衡被打破，從而引起膜受損[13]。植物器官在衰老或逆境條件下，受自由基的毒害會發(fā)生膜脂的過氧化作用，MDA是生物膜中不飽和脂肪酸分解后的一種產(chǎn)物，是反應(yīng)植物遭受逆境傷害程度的良好指標(biāo)。草甘膦是一種廣譜性的除草劑，它能在綠色植物組織內(nèi)從光系統(tǒng)中產(chǎn)生O2-，且能轉(zhuǎn)化成H2O2和·OH等一系列活性氧，而這些活性氧對細(xì)胞本身就有毒害，而SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中最重要的3種酶。因此，POD、SOD和CAT活性以及MDA含量的變化，能反映植物細(xì)胞受傷害的程度以及抗氧化脅迫能力的大小[14]，從而反映植物抗性的強弱。相關(guān)研究表明，植物SOD、POD、CAT活性和MDA含量隨草甘膦的加強或時間的延長，表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢[8,10]。也有研究表明，草甘膦處理下，MDA含量隨草甘膦濃度的增大而降低[15]。

研究表明，不同濃度的草甘膦脅迫均增大馬唐葉片SOD、POD和CAT活性以及MDA的含量，第6天達最大值，然后又緩慢下降，至第12天時，450、900和1 800 g/hm2草甘膦處理的 MDA含量和POD活性均降至對照水平，且各處理之間無顯著性差異，這說明草甘膦的脅迫使馬唐受到了抗氧化損傷，進而大大誘發(fā)其保護酶活性的升高從而增強其對逆境的適應(yīng)能力，尤其是高濃度組。與對照組相比，所有草甘膦處理組的MDA含量都有所增加，說明馬唐確實受到草甘膦引起的氧化損傷，但草甘膦脅迫后第12天，草甘膦處理各組的MDA含量均已下降，且450～1 800 g/ hm2草甘膦處理馬唐的MDA含量與對照無顯著性差異。這說明馬唐對草甘膦有一定的抗性，馬唐經(jīng)過一定時間能自行修復(fù)，緩解了其質(zhì)膜過氧化程度，尤其低濃度草甘膦處理馬唐所受到的氧化損傷較小且已恢復(fù)至正常水平，這與原向陽等[10]的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，草甘膦脅迫提高了馬唐葉片的SOD、POD、CAT活性，增加了MDA的含量；正常條件下，450、900和1 800 g/hm2草甘膦對馬唐的傷害可以經(jīng)過馬唐一段時間的生長發(fā)育而恢復(fù)，進而說明馬唐對草甘膦較易產(chǎn)生耐藥性。

[1]Baerson S R, Rodriguez D J, Tran M, et al.Glyphosate-Resistant Goosegrass.Identification of a mutation in the target Enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase[J].Plant Physiology，2002，129（3）：1265-1275.

[2]黃兆峰.田旋花對草甘膦耐藥性的分子機制[D].北京：農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

[3]朱文達，崔海芝，何燕紅，等.幾種除草劑防除棉田雜草馬唐試驗[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47（10）：1171-1173.

[4]Sammons R D, Gaines T A.Glyphosate resistance: state of knowledge[J].Pest Management Science，2014，70（9）：1367-1377.

[5]鞏元勇，郭書巧，束紅梅，等.抗草甘膦雜草的抗性機理研究進展[J].雜草科學(xué)，2012，30（3）：9-13.

[6]楊 濤，李傳勇，湯惠華.樂果對菠菜葉片POD、SOD、CAT活性及MDA含量的影響[J].亞熱帶植物科學(xué)，2004，33（4）：19-21.

[7]張 瓊，袁興超，裴兆虎，等.草甘膦對銅綠微囊藻生長的影響及其機理研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（36）：157-159.

[8]張靜潮，楊冬鶴.常溫和低溫下草甘膦對鐵皇冠SOD、CAT、POD活性和MDA含量的影響[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2010，26（4）：90-95.

[9]于孝保，朱繼宏，付德峰，等.4種蔬菜中SOD活性測定研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（11）：82-88.

[10]原向陽，郭平毅，張麗光，等.干旱脅迫下草甘膦對抗草甘膦大豆幼苗保護酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（4）：698-705.

[11]韓志萍，楊志紅，吳 湘.鉛脅迫對蘆竹抗氧化酶活性的影響[J].核農(nóng)學(xué)報，2010，24（4）：846-850.

[12]張 瓊，袁興超，裴兆虎，等.草甘膦對銅綠微囊藻生長的影響及其機理研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（36）：157-159.

[13]王寶山.生物自由基與植物膜傷害[J].植物生理學(xué)通訊，1988，（2）：12-16.

[14]吳仁海，孫慧慧，蘇旺蒼，等.精惡唑禾草靈對粳稻和秈稻生長及保護酶系的影響研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2013，28（5）：163 -168.

[15]田學(xué)軍，陶宏征，沈云玫，等.草甘膦對三葉鬼針草種子活力和幼苗保護酶活性的影響[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2015，14（6）：44-48.

（責(zé)任編輯：夏亞男）

Influences?of?Herbicide?Glyphosate?on?Antioxidant?Enzyme?System?and?MDA?Content?of?Digitaria sanguinalis

XIA Ai-lian1，JIN Chen-zhong1,2,3，HU Yi-hong1,2,3，LIU Xiao1，ZOU Ting-ting1,2，WANG Yan1,2,3
（1.College of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC; 2.Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Field Weeds Control, Loudi 417000, PRC; 3.Key Laboratory of Pesticide Harmless Application, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC）

The time-dependent changes of the activities of three antioxidant enzymes and the content of malonaldehyde in Digitaria sanguinalis were studied byspraying different concentrations of glyphosate.The three antioxidant enzymes mentioned above include superoxide dismutase, peroxidase and Catalase.The results showed that compared with the control value, the activities of three antioxidant enzymes and the content of malonaldehyde are somewhat increased during the initial stage after spraying glyphosate.All the indexes peak 6 days after spraying glyphosate.After the ninth day, all the indexes decreased.After the twelfth day, when the glyphosate concentration was 400, 90 and 1 800 g/hm2, the activities of SOD, POD and CAT and the content of MDA in Digitaria sanguinalis decreased to the control level.Under normal circumstances, Digitaria sanguinalis damaged by glyphosate continued to grow over a period of time.At the same time, it also suggested that Digitaria sanguinalis has certain resistance to glyphosate.

glyphosate; Digitaria sanguinalis; antioxidant enzyme system; malondialdehyde

S451

A

1006-060X（2016）11-0024-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.011.008

2016-08-05

湖南省教育廳青年項目（16B137）；婁底市科技計劃項目（201304）；湖南人文科技學(xué)院產(chǎn)學(xué)研合作引導(dǎo)項目（2014CXY06，2013CXY04）；湖南省高校產(chǎn)業(yè)化培育項目（13CY030）；湖南省高校創(chuàng)新平臺基金（15K066）

夏愛蓮（1996-），女，湖南婁底市人，本科生，生物技術(shù)專業(yè)。

王 艷