李單琦，謝德金，王漢琪，周少卿，榮俊冬，何天友，鄭郁善

（福建農(nóng)林大學(xué) a.藝術(shù)園林學(xué)院；b.工業(yè)原料林研究所，福建 福州 350002）

福建柏遺傳多樣性ISSR分析

李單琦a，謝德金b，王漢琪b，周少卿b，榮俊冬b，何天友b，鄭郁善b

（福建農(nóng)林大學(xué) a.藝術(shù)園林學(xué)院；b.工業(yè)原料林研究所，福建 福州 350002）

采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)我國(guó)瀕危植物福建柏的7個(gè)種群進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示：17個(gè)引物共擴(kuò)增出202個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)167個(gè)，占總位點(diǎn)的82.67%；引物UBC849可以將24份福建柏樣本完全鑒別出來(lái)；7個(gè)福建柏種群的多態(tài)位點(diǎn)百分率在17.82%～54.95%之間；群體總觀測(cè)等位基因數(shù)Na為1.821 8，有效等位基因數(shù)Ne為1.431 3，Nei指數(shù)為0.258 2，Shannon指數(shù)為0.394 0；種群內(nèi)平均Na指數(shù)為1.372 0，平均Ne指數(shù)為1.289 2，平均Nei指數(shù)為0.160 0，平均Shannon指數(shù)為0.203 5；基因分化系數(shù)Gst為32.41%，種群間基因流Nm為0.878 0；7個(gè)種群遺傳相似度在0.668 3～0.806 9之間，遺傳距離在0.214 5～0.404 3之間；利用UPGMA法進(jìn)行聚類，將泉州市、福州市和龍巖市種群分為第一類，將南平市、三明市和漳州市種群分為第二類，將寧德市種群分為第三類。

福建柏；ISSR；遺傳多樣性；聚類分析

福建柏Fokienia hodginsii 又稱建柏，為裸子植物門柏科綱福建柏屬的單一種植物[1]。從福建柏葉片中提取出的精油，具有殺滅蚊蟲作用[2]。福建柏是一種古老的孑遺植物，也是我國(guó)珍貴的瀕危物種，被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)樹種，為福建省鄉(xiāng)土樹種[3]?，F(xiàn)階段福建柏研究主要集中在群落研究、造林研究、育苗研究、種源研究等方面，對(duì)其遺傳多樣性僅從過(guò)氧化物同工酶角度進(jìn)行粗略的分析[4]，為了研究福建柏致瀕機(jī)理以及提出切實(shí)可行的保護(hù)策略，有必要從DNA分子水平上對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行深入研究。

ISSR DNA分子標(biāo)記技術(shù)（簡(jiǎn)單重復(fù)序列inter simple sequence repeat）[5]最早于1994年由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz教授等人提出[6]。這種標(biāo)記根據(jù)廣泛存在于植物中的微衛(wèi)星序列（SSR）[7]，在其3′或5′端加上2～4個(gè)非重復(fù)隨機(jī)的核苷酸序列作為PCR反應(yīng)引物[8]，引起特定位點(diǎn)退火并對(duì)間隔不大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[6]，再根據(jù)譜帶類型對(duì)各樣品的遺傳多樣性等進(jìn)行分析[9]。ISSR標(biāo)記以其引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、產(chǎn)物具有較好的穩(wěn)定性與多態(tài)性[10]、重復(fù)性好[11]、DNA用量較小、安全性高[12]、技術(shù)難度和復(fù)雜度較低、耗時(shí)少、成本低等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于我國(guó)特有瀕危植物的研究[13-16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)福建省7個(gè)福建柏種群的24個(gè)樣本進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記研究，旨在揭示福建柏遺傳多樣性水平，研究其致瀕原因，為福建柏種質(zhì)資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所采用的福建柏樣品于2013年3月至4月在福建省內(nèi)各福建柏天然林、人工林和古樹進(jìn)行采集。7個(gè)福建柏種群信息詳見(jiàn)表1。

表1 福建柏種群信息Table 1 The population information of Fokienia hodginsii

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè)

福建柏基因組DNA采用天根試劑盒提取，并在胡迪科等人[17]的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)；提取產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP 2000 C分光光度計(jì)分析質(zhì)量和濃度，于-20℃保存。

1.2.2 擴(kuò)增體系

對(duì)影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的各因素進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定福建柏ISSR-PCR反應(yīng)體系為：總體積為20 mL，其中10′PCR buffer 2 mL，Mg2+濃度 1.8 mmol·L-1，dNTPs 濃度 0.25 mmol·L-1，Taq酶濃度0.25 U，引物濃度0.7 mmol·L-1，模板DNA用量50 ng，最后用滅菌蒸餾水補(bǔ)齊至20 mL[18]。擴(kuò)增體系為：94 ℃預(yù)變性5 min，接著94 ℃變性30 s、48.6 ℃退火40 s、72 ℃延伸2 min，此3步進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，反應(yīng)完畢后于4 ℃環(huán)境保存[19]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)24份福建柏樣品DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，根據(jù)凝膠成像分析儀觀察電泳圖上是否有條帶，將同一位點(diǎn)上有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0，對(duì)每一引物擴(kuò)增結(jié)果建立二元數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)總位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)并構(gòu)建指紋圖譜；運(yùn)用POPGENE 32基因軟件對(duì)此0、1矩陣進(jìn)行分析，分析指標(biāo)主要有：多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon多樣性指數(shù)、基因多樣性指數(shù)（I）、遺傳分化系數(shù)（Gst）、種群總基因多樣性（Ht）、種群內(nèi)基因多樣性（Hs）、基因流（Nm）、遺傳距離與遺傳相似度。根據(jù)種群間遺傳距離，運(yùn)用UPGMA法對(duì)福建柏各種群間親緣關(guān)系進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，最終確定17條條帶清晰、明亮度好、多態(tài)性豐富的引物進(jìn)行福建柏ISSR研究，同時(shí)對(duì)每一引物篩選最佳退火溫度。篩選出的17條引物占所有引物的17%，對(duì)供試的24份福建柏材料共擴(kuò)增出202個(gè)重復(fù)性好、清晰穩(wěn)定的位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)167個(gè)，占總位點(diǎn)的82.67%；各個(gè)引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)在9～16個(gè)之間，平均11.88個(gè)位點(diǎn)；多態(tài)性位點(diǎn)在5～14個(gè)之間，平均9.82個(gè)；各個(gè)引物檢測(cè)出的DNA片段大小范圍在200～4 500 bp之間，說(shuō)明福建柏有較長(zhǎng)的基因組；各引物擴(kuò)增結(jié)果的多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)在50.00%～100%之間，平均為82.09%。結(jié)果顯示，17條ISSR引物均能擴(kuò)增出高多態(tài)性的位點(diǎn)，由此顯示了福建柏具有非常豐富的多態(tài)性（詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2）。

2.2 指紋圖譜的構(gòu)建

種質(zhì)資源鑒別是ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的重要作用之一，根據(jù)引物擴(kuò)增結(jié)果顯示的特殊條帶，可以快速有效地進(jìn)行種質(zhì)資源鑒別，因此篩選出最少的引物以獲得最大的鑒別能力，對(duì)于種質(zhì)資源鑒別尤為重要。通過(guò)對(duì)17個(gè)引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)篩選比較后發(fā)現(xiàn)，引物UBC849可以將供試的24份福建柏樣本完全鑒別出來(lái)，表現(xiàn)出較好的鑒別能力，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。將擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)字轉(zhuǎn)化（有條帶記為1，無(wú)條帶記為0），形成特有的分子身份證編碼，為福建柏構(gòu)建一個(gè)基于ISSR分析的DNA指紋圖譜（見(jiàn)表3）。

2.3 福建柏遺傳多樣性分析

多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）指標(biāo)對(duì)于衡量植物種

群間遺傳變異水平的高低非常重要，若一個(gè)植物種群的PPB值高則說(shuō)明該種群對(duì)于當(dāng)前環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，可以繼續(xù)繁衍下去；若PPB值低則說(shuō)明其環(huán)境適應(yīng)能力較弱，有滅絕的可能性，需要及時(shí)對(duì)其采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施。由表4可知，7個(gè)福建柏種群多態(tài)位點(diǎn)百分率有較大差異，PPB值在17.82%～54.95%之間，平均為37.20%。其中多態(tài)位點(diǎn)百分率最高的為泉州市種群，其次為三明市種群，說(shuō)明這兩個(gè)種群福建柏適應(yīng)性強(qiáng)，遺傳多樣性豐富，遺傳基礎(chǔ)較寬，是良種選育的最佳種源地；多態(tài)位點(diǎn)百分率最低的為漳州市種群，其次為南平市種群，說(shuō)明這兩個(gè)種群的福建柏適應(yīng)環(huán)境能力較差，需要加強(qiáng)保護(hù)，否則會(huì)導(dǎo)致滅絕。

表2 引物檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of primers

圖1 引物UBC849擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The ampli fi cation results by primer UBC849

表3 24份福建柏樣本ISSR身份證編碼Table 3 The ISSR ID code of 24 samples of Fokienia hodginsii

利用POPGENE 32軟件分別對(duì)7個(gè)福建柏種群的遺傳多樣性進(jìn)行總體和單獨(dú)分析，結(jié)果顯示：7個(gè)種群總體觀測(cè)等位基因數(shù)為1.821 8，有效等位基因數(shù)為1.431 3，Nei遺傳多樣性指數(shù)為0.258 2，Shannon信息指數(shù)為0.394 0，顯示了7個(gè)福建柏種群間豐富的遺傳多樣性；7個(gè)群體的總遺傳多樣性為0.258 2，種群內(nèi)遺傳多樣性為0.174 5，種群間分化水平為0.324 1，表明在總遺傳多樣性變異中，有32.41%的變異存在于種群間，有67.59%的變異存在于種群內(nèi)；種群間基因流為0.878 0，表明各種群間存在較小的基因交流，有增加種群間遺傳變異的可能性[20]。

由表4、圖2可知，7個(gè)種群的Na指數(shù)在1.178 2～1.545 9之間，平均為1.372 0；Ne指數(shù)在1.787 2～1.356 3之間，平均為1.289 2；Nei指數(shù)在0.089 1～0.205 2之間，平均為0.160 0；Shannon指數(shù)在0.123 5～0.305 7之間，平均為0.203 5。種群間遺傳多樣性由大到小排列為泉州市＞三明市＞福州市＞寧德市＞龍巖市＞南平市＞漳州市。

2.4 種群間親緣關(guān)系

由表5可知，7個(gè)種群遺傳相似度在0.668 3～0.806 9之間，平均為0.765 5，遺傳距離在0.214 5～0.404 3之間，平均為0.289 5；其中親緣關(guān)系最近的是福州市與龍巖市種群，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是泉州市和寧德市種群。

圖2 福建柏7種群遺傳多樣性比較Fig. 2 The comparison among 7 populations of F’s genetic diversity

表5 7個(gè)種群間遺傳相似度(對(duì)角線上方)和遺傳距離(對(duì)角線下方)Table 5 Genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among 7 populations

采用UPGMA法構(gòu)建基于遺傳距離的聚類圖（見(jiàn)圖3），7個(gè)種群可以分為三類：第一類包括泉州市、福州市和龍巖市種群；第二類包括南平市、三明市和漳州市種群；第三類包括寧德市種群。

圖3 7個(gè)福建柏種群的聚類樹狀圖Fig. 3 Dendrogram of 7 populations of Fokienia hodginsii

3 討 論

植物遺傳多樣性是其所攜帶遺傳信息的總和，是植物種群生存、發(fā)展進(jìn)化的基礎(chǔ)。遺傳多樣性水平可以反映出一個(gè)植物群體在其生長(zhǎng)環(huán)境中基因的豐富程度，也決定其對(duì)于環(huán)境變化的適應(yīng)能力。因此對(duì)植物遺傳多樣性進(jìn)行研究，可以清楚地了解到不同地區(qū)種群的適應(yīng)性與生長(zhǎng)發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)植物種質(zhì)資源的良種選育工作以及瀕危植物的致瀕機(jī)理研究等具有重要意義。

多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）指標(biāo)是衡量植物種群對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的重要指標(biāo)之一，本研究對(duì)福建省的7個(gè)福建柏種群的PPB進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，各種群間有較大差異，表明不同地區(qū)環(huán)境因素對(duì)福建柏生長(zhǎng)有較大影響，其中環(huán)境適應(yīng)力最差的為漳州市和南平市種群，因此應(yīng)及時(shí)對(duì)其進(jìn)行加強(qiáng)保護(hù)，防止在自然選擇過(guò)程中被淘汰。

本研究結(jié)果表明，福建柏種群間和種群內(nèi)均具有較高的遺傳多樣性[21]，7個(gè)種群總體觀測(cè)等位基因數(shù)為1.821 8，有效等位基因數(shù)為1.431 3，Nei遺傳多樣性指數(shù)為0.258 2，Shannon信息指數(shù)為0.394 0；種群內(nèi)觀測(cè)等位基因指數(shù)平均為1.372 0，有效等位基因指數(shù)平均為1.289 2，Nei指數(shù)平均為0.160 0，Shannon指數(shù)平均為0.203 5[22]。由此表明，導(dǎo)致福建柏瀕危并非由于遺傳多樣性的缺乏，而是受到其他因素影響。

一個(gè)植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了其進(jìn)化潛力，而遺傳結(jié)構(gòu)主要通過(guò)種群間分化水平體現(xiàn)的，若一個(gè)植物種群間遺傳分化系數(shù)較高，說(shuō)明需要保護(hù)較多的種群，反之則僅需保護(hù)較少種群。福建省內(nèi)的福建柏種群間分化水平為0.324 1，表明遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，只需要對(duì)部分種群進(jìn)行保護(hù)。

導(dǎo)致種群間出現(xiàn)遺傳分化的主要原因是自然選擇的作用，而基因流是對(duì)抗自然選擇的重要因素。一般認(rèn)為，當(dāng)植物種群間基因流大于1時(shí)，可以防止近交衰退而保持較高的遺傳多樣性；若基因流小于1，則會(huì)引起種群間遺傳分化[23]。福建柏7個(gè)種群的基因流為0.878 0，小于1，表明種群間存在一定的遺傳分化。

綜上所述，導(dǎo)致福建柏成為瀕危植物的主要原因是人為對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境的破壞，導(dǎo)致其居群規(guī)模不斷減小，生境片段化，使種群間基因交流減少，增加了近交和遺傳漂變作用。因此，需要及時(shí)采取相應(yīng)保護(hù)措施，抑制福建柏種群的衰敗趨勢(shì)。首先，應(yīng)該對(duì)現(xiàn)有的福建柏資源進(jìn)行就地保護(hù)，建立保護(hù)區(qū)，禁止亂砍亂伐，保護(hù)其生長(zhǎng)環(huán)境；其次，對(duì)福建柏生態(tài)學(xué)特性進(jìn)行研究，制定科學(xué)的保護(hù)方法；第三，加強(qiáng)人工繁育力度，運(yùn)用組織培養(yǎng)或扦插等方式進(jìn)行大量培育；第四，加大種群間基因交流，將各種群采集的大量種子和幼苗進(jìn)行交換種植，人為增加基因交流，以便更好地保持、提高福建柏遺傳多樣性水平。

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ISSR analysis on genetic diversity of Fokienia hodginsii

LI Dan-qia, XIE De-jinb, WANG Han-qib, ZHOU Shao-qinb, RONG Jun-dongb, HE Tian-youb, ZHENG Yu-shanb
(a.College of Arts & Landscape Architecture; b. Industrial Raw Material Forest Institute, Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002, Fujian, China )

This paper studied the genetic diversity of 7 populations of endangered plants Fokienia hodginsii by using ISSR markers technique. The results showed that 17 primers ampli fi cation 202 loci, 167 polymorphic loci, accounting for 82.67%. The 24 samples could be identi fi ed ef fi ciently by primer UBC849. The percentage of polymorphic loci was between 17.82% and 54.95%, at species level the observed number of alleles was 1.8218, the effective number of alleles was 1.4313, Nei’s genetic diversity was 0.2582, Shannon’s index was 0.3940, at population level they were 1.3720, 1.2892, 0.1600 and 0.2035. The gene differentiation coef fi cient was 32.41%and gene fl ow was 0.8780. The genetic identity was between 0.6683 and 0.8069, the genetic distance was between 0.2145 and 0.4043.Through cluster analysis by UPGMA, the 7 populations of Fokienia hodginsii were classi fi ed into 3 groups, the fi rst group including populations of Quanzhou city, Fuzhou city and Longyan city, the second group including populations of Nanpin city, Sanming city and Zhangzhou city, the last group was population of Ningde city.

Fokienia hodginsii; ISSR; genetic diversity; clustering analysis

S791.43

A

1673-923X(2016)05-0063-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.05.012

2015-02-02

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2011BAI01B06）

李單琦，碩士研究生 通訊作者：鄭郁善，教授；E-mail：zys1960@163.com

李單琦，謝德金，王漢琪，等. 福建柏遺傳多樣性ISSR分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016, 36(5): 63-67, 78.

[本文編校：謝榮秀]