張瑋珊，姜虹芮,呂建群，

(1.成都七中，四川 成都 610041;2.成都樹(shù)德中學(xué)，四川 成都 610031；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,四川 成都 610066)

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褐飛虱的飼養(yǎng)及抗褐飛虱水稻鑒定方法

張瑋珊1，姜虹芮2,呂建群3，

(1.成都七中，四川 成都 610041;2.成都樹(shù)德中學(xué)，四川 成都 610031；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,四川 成都 610066)

本文簡(jiǎn)述了褐飛虱蟲源飼養(yǎng)的基本工具、條件和方法，并對(duì)22份水稻材料進(jìn)行了褐飛虱抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)和網(wǎng)室接蟲鑒定。結(jié)果表明，抗飛虱對(duì)照材料Ptb33及含有純合抗蟲基因(R)或雜合抗蟲基因(H)的水稻材料，網(wǎng)室接蟲鑒定抗性級(jí)別為1～5級(jí)，具有較好的褐飛虱抗性；感蟲對(duì)照TN1及含有感蟲基因(S)的材料抗性級(jí)別為7-9級(jí)，均表現(xiàn)為感蟲。

褐飛虱；飼養(yǎng)；抗性鑒定；分子標(biāo)記；抗蟲基因

1 褐飛虱蟲源飼養(yǎng)條件及工具

褐飛虱的飼養(yǎng)工具主要包括養(yǎng)蟲室、養(yǎng)蟲架、養(yǎng)蟲籠及一些必備的操作用具等。

1.1 養(yǎng)蟲室

15～20m2溫室,裝一臺(tái)冷暖型1.5匹空調(diào)機(jī),要求用水用電方便。

1.2 養(yǎng)蟲架

用角鐵焊置成高1m,長(zhǎng)1.2m,寬1.1m支架,置放在地上。

1.3 養(yǎng)蟲籠

在養(yǎng)蟲架上面放置長(zhǎng)寬均為1m，高為1.5m的框架上，再裝上4支50W節(jié)能日光燈。四周和頂部均為紗網(wǎng),一面為門且要合縫,以防天敵進(jìn)入(圖1)。

1.4 飼養(yǎng)盆

在市場(chǎng)上購(gòu)買的長(zhǎng)0.8m,寬0.5m，高0.2m的塑料盆。

1.5 其它用具

塑料盒(10cm×50cm×3cm)、定時(shí)器、培養(yǎng)架等。

1.6 飼養(yǎng)環(huán)境條件

溫度控制在26～32℃,濕度控制在85%以上。

2 飼養(yǎng)方法

2.1 飼養(yǎng)苗培育

將感蟲品種TN1種子均勻地撒播在事先放有濕潤(rùn)紙巾的塑料盒內(nèi)，整齊地放在培養(yǎng)架上，蓋上薄膜，2～3d后即可出芽。

2.2 褐飛虱飼養(yǎng)

將3葉1心的飼養(yǎng)苗放入塑料盆中，加入適當(dāng)?shù)乃押诛w虱蟲源放在盆中飼養(yǎng)苗上，經(jīng)過(guò)連續(xù)繁殖加代獲得充足蟲源。

圖1 部分飼養(yǎng)工具

3 抗褐飛虱水稻的鑒定

3.1 抗性鑒定材料

以公認(rèn)的抗飛虱水稻材料Ptb33為抗蟲對(duì)照，以TN1為感蟲對(duì)照，另選擇22份水稻育種材料進(jìn)行鑒定。所有材料均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

3.2 稻飛虱接蟲鑒定方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

稻飛虱接蟲鑒定采用改進(jìn)的苗期集團(tuán)篩選法[1]。先將水稻種子浸種、催芽,待其露白后整齊播種于網(wǎng)室水泥池中。每個(gè)材料播約20粒正常發(fā)芽的種子,每20個(gè)鑒定材料后插播感蟲對(duì)照TN1和抗蟲對(duì)照PTB33。每個(gè)材料3次重復(fù),隨機(jī)排列。待秧苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)定苗,每個(gè)材料留15株,按平均每株7～12頭接入褐飛虱2～3齡若蟲，并用透光性良好的紗網(wǎng)罩住。待感蟲品種TN1死苗率接近95%時(shí)開(kāi)始調(diào)查(圖2),按國(guó)際水稻所的抗蟲性鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)級(jí)[2-3](表1)。根據(jù)評(píng)級(jí)的結(jié)果采用平均法計(jì)算出各材料的受害等級(jí)(受害等級(jí)與抗性的關(guān)系詳見(jiàn)表1)。

表1 水稻種質(zhì)資源苗期抗稻飛虱鑒定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

表2 22份水稻材料網(wǎng)室的抗性級(jí)別及分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

注：R：純合抗蟲基因；H：雜合抗蟲基因；S：感蟲基因；CK1：抗飛虱對(duì)照Ptb33；CK2:感飛虱對(duì)照TN1。

3.3 抗飛虱基因分子標(biāo)記輔助選擇方法

采用改良的CTAB法從水稻苗期葉片提取基因組DNA，利用已經(jīng)定位或克隆的抗飛虱基因區(qū)段設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)的總體系為25μL，包括樣品基因組DNA 2μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL，引物2μL，dNTP 2μL，Taq酶0.25μL，蒸餾水16.25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min；94℃變性45s,50～65℃退火30s(退火溫度依據(jù)不同引物而定),72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠或6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，通過(guò)檢測(cè)片段有無(wú)判斷樣品是否含有抗性基因，或通過(guò)片段大小區(qū)分純合和雜合抗性基因。

4 結(jié)果與分析

對(duì)2份抗感蟲對(duì)照材料及22份育種材料的接蟲鑒定和抗性基因分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，抗蟲對(duì)照Ptb33和3份育種材料含有純合抗蟲基因(R)，抗性級(jí)別為1～5級(jí)，抗性水平為中抗到高抗；有6份育種材料含有雜合抗蟲基因(H)，抗性級(jí)別為3～5級(jí)，抗性水平為中抗到抗；感蟲對(duì)照TN1和9份育種材料含有感蟲基因(S)，抗性級(jí)別為7～9級(jí)，抗性水平為感蟲到高感(表2，圖3)。由此結(jié)果說(shuō)明，利用抗性基因分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與網(wǎng)室接蟲鑒定抗性級(jí)別吻合。在水稻抗性育種進(jìn)程中，結(jié)合利用抗飛虱基因分子標(biāo)記輔助選擇可提高育種選擇效率和水稻材料的抗性水平。

圖2 水稻材料網(wǎng)室鑒定

圖3.抗飛虱基因Bph～ptb的分子標(biāo)記檢測(cè)13.抗飛虱親本Ptb33；14：感飛虱親本TN1；1～12，15～24：育種材料

[1]陳建明,俞曉平,程家安,等.水稻新品種(系)對(duì)褐飛虱抗性的篩選及評(píng)價(jià)[J].中國(guó)水稻科學(xué),2005,19(6):573-576.

[2]Heinrichs E A, Medrano F. Genetic evaluation for insect resistance in rice[J]. Manila: IRRI,1985. 92-110.

[3]楊長(zhǎng)舉,楊志慧,胡建芳,等.野生稻轉(zhuǎn)育后代對(duì)褐飛虱抗性的研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),1999,26(3):197-202.