劉 悅 湯 歡 李西文 陳增華 雷志勇 向 麗

(1 中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京，100700； 2 北京千菌方菌物科學研究院，北京，100005)

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基于ITS序列的傘菌類藥用食用真菌的DNA條形碼鑒定研究

劉 悅1湯 歡1李西文1陳增華2雷志勇2向 麗

(1 中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京，100700； 2 北京千菌方菌物科學研究院，北京，100005)

目的：傘菌類真菌物種繁多、生物多樣性豐富，包括多種重要的藥用、食用真菌以及有毒真菌。因此，對該類群的快速、準確鑒定，對于新的藥用食用真菌資源的發(fā)現(xiàn)，以及對真菌毒素危害的防治都具有重要意義。方法：本研究以傘菌類13個科23個屬50個物種，共計84份樣本的真菌為研究對象，采用真菌通用引物ITS5和ITS4，對其核糖體DNA的內轉錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)進行PCR擴增和測序。通過比較不同真菌的序列長度、堿基構成，同時利用BLAST比對法和建樹法對其進行鑒定。結果：傘菌類真菌的序列長度在463～751 bp之間，平均GC含量在37.1%～59.4%之間。通過與GenBank中序列的比對分析以及系統(tǒng)進化鄰接(Neighbor-joining，NJ)樹結果，可以在種級水平上鑒定各個真菌物種。結論：基于ITS序列的DNA條形碼可以快速、準確鑒定傘菌類真菌，具有重要的應用價值。

藥用真菌；食用真菌；傘菌類；DNA條形碼；ITS

傘菌目(Agaricales)又稱蘑菇目，為擔子菌一個大目，特點是具有菌蓋和菌柄，呈蘑菇狀。傘菌類真菌多成世界性分布，從北極至熱帶的多林地帶都有發(fā)現(xiàn)。目前，傘菌目已有33個科，413個屬，13 000余個物種已被識別，我國已報道的物種約占全世界已知物種的1/5[1]。在傘菌類真菌中，包括有味道鮮美而具有較高營養(yǎng)價值的食用菌，如側耳科側耳屬的刺芹側耳、白靈側耳等；有重要的藥食兩用真菌，如側耳科側耳屬的金頂側耳和光柄菇科小包腳菇屬的草菇等；此外，傘菌類真菌還包括較多含有毒性的真菌，如球蓋菇科垂幕菇屬的簇生黃韌傘、白蘑科杯傘屬的白杯傘以及鵝膏菌科鵝膏屬的致命鵝膏等[2-5]。由此可見，傘菌類真菌具有豐富的物種多樣性，實現(xiàn)對該類群的快速、準確鑒定，對于新的藥用食用真菌資源的發(fā)現(xiàn)，以及對有毒真菌的預防等都具有重要意義。

DNA條形碼從基因角度解釋了藥用動植物物種鑒定的問題[6]。近年來，隨著該方法的深入研究與普及，該方法已經(jīng)成為傳統(tǒng)鑒定方法的有效補充，并成為藥用動物、植物鑒定的重要方法[6，8-12]。如，DNA條形碼技術對名貴真菌類藥材冬蟲夏草、靈芝及其混偽品等[13-17]。傳統(tǒng)的傘菌類真菌分類與鑒定多是根據(jù)子實體以及孢子等的形態(tài)特征，但有時會受到環(huán)境影響，真菌的形態(tài)差異會有較大差異，給鑒定帶來一定困難[18]。此外，一些真菌的培養(yǎng)物只有菌絲體，而不產生孢子，更加大了鑒定的難度[19]。近年來，研究者們采用DNA條形碼技術對真菌的分類與鑒定展開了大量的研究[20-22]。在對菌物DNA條形碼標準序列篩選的過程中發(fā)現(xiàn)，ITS序列適宜的真菌類群范圍較廣，引物通用性強，PCR擴增、測序以及鑒定成功率都相對較高。此外，在GenBank等數(shù)據(jù)庫中存有大量的真菌ITS序列，更便于真菌序列的比對研究[19]。在第四屆國際生命條形碼大會上正式推薦了ITS作為真菌的首選DNA條形碼[4，19]。本研究應用ITS序列，以傘菌類13個科23個屬50個物種，共計84份樣本為研究對象，探索ITS序列對傘菌類真菌鑒定的可行性與可靠性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 本研究以本研究以傘菌類13個科23個屬50個物種，共計84份樣本的真菌為研究對象，進行DNA條形碼鑒定研究，實驗材料經(jīng)中國科學院微生物研究所卯曉嵐研究員鑒定。憑證標本存放于中國中醫(yī)科學院中藥研究所，詳細研究材料見表1。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序 用75%乙醇擦拭真菌后，刮去其表面，取其內部組織約30 mg，用高通量組織研磨儀(寧波新芝，中國)研磨200 s(50 Hz)后，利用真菌基因組DNA提取試劑盒(BioTeke公司，中國)提取總DNA。擴增ITS序列正向引物ITS5F：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，反向引物ITS4R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR反應體積25 μL，PCR反應體系為25 μL，包括2×Tag PCR MasterMix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板2～3 μL，其余體積以ddH2O補充。序列擴增及測序均依照中藥材DNA條形碼分子鑒定標準操作流程(DNA barcoding SOP)進行[23-24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖使用CodonCode Aligner V 3.7.1(CodonCode Co.，USA)進行質量校對與拼接，去除低質量序列及引物區(qū)，進行多序列比對并人工校驗。將所有獲得的ITS序列用MEGA6.0(Center for Evolutionary Medicine and Informatics，USA)(MUSCLE option)進行序列分析比對。最后采用相似性搜索法(BLAST)，以及構建系統(tǒng)進化鄰接樹(neighbor-joining method)的方法來考察ITS序列鑒定的成功率。

2 結果

2.1 傘菌類真菌ITS序列特征 實驗結果表明，ITS序列在傘菌類真菌樣本中顯示出較好的通用性，PCR擴增效率和測序成功率均為100%。比較84條ITS序列后發(fā)現(xiàn)：各個物種的序列長度各有差異(表1)，其中蠟傘科(Hygrophoraceae)的Hygrophorusquercetorum序列長度最短，為463 bp；膨瑚菌科(Physalacriaceae)科的假蜜環(huán)菌Armillariatabescens序列長度最長，為751 bp。各物種的平均GC含量在37.1%～59.4%之間，蠟傘科(Hygrophoraceae)科的Hygrophorusquercetorum最低，而光柄菇科(Pluteaceae)科的草菇Volvariellavolvacea平均GC含量最高。

2.2 相似性搜索結果 本文采用比對法(BLAST)對84條實驗序列進行鑒定，結果表明在屬水平上鑒定成功率為100%；在物種水平上，鑒定成功率為89%，有9個真菌樣本在GenBank中未能搜索到相同序列，僅能比對到屬，這些真菌包括芳香杯傘Clitocybefragrans、大白樁菇Leucopaxillusgiganteus、側耳Pleurotusostreatus、Hypholomadispersum、Hygrophorusquercetorum、灰紫鱗絲蓋傘Inocybegriseolilacina、Inocybejacobi以及Lycoperdoncaudatum。

2.3 系統(tǒng)進化樹鑒定結果 從基于ITS序列的系統(tǒng)進化NJ樹看出(圖1)，ITS序列可以鑒定實驗研究所用的傘菌類的13個科23個屬50個物種。其中，在BLAST比對法中僅能比對到屬水平的9個物種在NJ樹中也都能夠與其他同屬物種分開，并各自為一支。此外，具有較高營養(yǎng)價值的真菌，如側耳科(Pleurotaceae)側耳屬的刺芹側耳(Pleurotuseryngii)、白靈側耳(Pleurotusnebrodensis)等；重要的藥食兩用真菌，如側耳科側耳屬的金頂側耳(Pleurotuscitrinopileatus)和光柄菇科(Pluteaceae)小包腳菇屬的草菇(Volvariellavolvacea)等，以及有毒的鵝膏菌科(Amanitaceae)科的鵝膏菌屬(Amanita)真菌、球蓋菇科(Strophariaceae)科垂幕菇屬(Hypholoma)真菌以及絲蓋傘科(Inocybaceae)科的絲蓋傘屬(Inocybe)真菌等均能夠與其他的真菌區(qū)分開。由此可見，采用基于ITS序列的系統(tǒng)進化NJ樹可以鑒定實驗研究中的50種傘菌類真菌。

圖1 基于IT序列構建的傘菌類50個物種的系統(tǒng)進化鄰接樹

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，全世界的真菌物種多達150萬余種，其數(shù)量和種類在生物界中僅次于昆蟲而位列第二[25]。真菌豐富的生物多樣性、重要的生態(tài)作用以及巨大的藥用、食用價值使其在生物中占有舉足輕重的地位。傳統(tǒng)的真菌鑒定方法主要以其形態(tài)特征、生理學特征以及生態(tài)學特征等作為判定依據(jù)。但是真菌種類繁多，個體多態(tài)性顯著或物種之間形態(tài)十分相似，易受培養(yǎng)條件等外界因素的影響，為真菌的鑒定帶來了一定的困難。與傳統(tǒng)分類鑒定方法不同，DNA條形碼克服傳統(tǒng)形態(tài)學表型相似或差異大、鑒定人員需具備較為扎實的專業(yè)知識等困難，從基因角度背景闡明物種來源，目前已成為物種快速鑒定的重要途徑。

表1 傘菌類實驗材料信息

由于真菌豐富的生物多樣性，研究者們對真菌DNA條形碼標準序列的選擇也做了大量的研究工作。其中COI和ITS序列被證明是在真菌鑒定工作中成功率較高的兩條序列[26-27]。研究表明，COI基因是內含子含量較多的序列，有時其片段長度超過20 bp，會影響PCR擴增而不利于獲取DNA序列[28]。而ITS序列引物通用性強，擴增成功率較高，更便于高通量測序與分析，因此更適合作為真菌鑒定的首選條形碼[19]。

本研究采用ITS序列對傘菌類13個科23個屬50種真菌進行鑒定研究。通過比較各個物種ITS序列發(fā)現(xiàn)，不同物種在序列長度以及堿基構成方面的差異。BLAST比對結果表明，除個別物種外，DNA條形碼鑒定結果與前期形態(tài)鑒定結果基本一致。結合NJ樹結果，則能將這50種傘菌類真菌物種鑒定到種級單元，并可確定同物異名的真菌。此外，側耳屬等重要藥用、食用真菌以及鵝膏屬、杯傘屬等有毒真菌均可與其他真菌物種明顯區(qū)分。因此，ITS序列在傘菌類真菌中鑒定的可行性，對未來傘菌類真菌的鑒定、有毒真菌與無毒真菌鑒定區(qū)分，以及藥用食用真菌的生產栽培以及開發(fā)利用都具有重要的意義。

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(2016-04-12收稿 責任編輯：洪志強)

Identification of Medicinal and Edible Fungi(Agaricales)Through Internal Transcribed SpacerBarcode

Liu Yue1，Tang Huan1，Li Xiwen1，Chen Zenghua2，Lei Zhiyong2，Xiang Li1

(1InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700,China; 2BeijingQianjunfangAcademyofFungalScience，Beijing100005,China)

Objective:With abundant fungi species and rich biodiversity，Agaricales comprises a variety ofmedicinal，edible and poisonous fungi.To identify these fungi have important significance for the discovery of new medicinal edible fungi resources，and the prevention of mycotoxin hazard.Methods:In this study，50 species belong to 23 genus of 13 families in Agaricales were identified by DNA barcode.The internal transcribed spacer(ITS)were amplified and sequenced.Sequence lengths，base compositions were compared，and sequences results were analyzed using BLAST.A phylogenetic neighbor-joining(NJ)tree was also constructed for the identification of above-mentioned species.Results:The results indicated that the ITS sequence lengths of 50 fungi species ranged from 463 to 751 bp and the GC content intermediate between 37.1% and 59.4%.Finally，all 50 species were clearly identified by BLAST and NJ tree.It is concluded that the ITS region can rapidly and accurately identify Agaricales species.Conclusion:The proposed DNA barcode has great application value in fungi species identification.

Medicinal Fungi；Edible Fungi；Agaricales；DNA barcode；ITS

中央科研院所公益項目(編號：ZXKT15029；ZZ2014029)；重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項(編號：2014ZX09304307001-014；2014ZX09301308-007)

向麗，助理研究員，主要研究方向：中藥資源栽培與藥用真菌分子鑒定，Tel：(010)84084107，E-mail：lxiang@icmm.ac.cn

R282

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.009