錢正明 甄達(dá)明 李文慶 李文佳 孫敏甜 楊豐慶 向 麗

(1 廣東東陽光藥業(yè)有限公司，東莞，523850； 2 重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶，400030； 3 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

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冬蟲夏草水提取過程中腺苷轉(zhuǎn)化途徑研究

錢正明1甄達(dá)明1李文慶1李文佳1孫敏甜1楊豐慶2向 麗3

(1 廣東東陽光藥業(yè)有限公司，東莞，523850； 2 重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶，400030； 3 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

目的：通過比較分析不同條件下冬蟲夏草中7個(gè)核苷類成分的含量變化，探究冬蟲夏草藥材在水提過程中腺苷的轉(zhuǎn)化途徑。方法：首先建立冬蟲夏草中7個(gè)核苷類成分(三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、單磷酸腺苷、腺苷、肌苷、次黃嘌呤和腺嘌呤)的高效液相定量分析方法，并用所建立的分析方法比較不同提取方法和水提取添加對(duì)照品前后各相關(guān)成分的含量。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)不同提取方法對(duì)冬蟲夏草腺苷含量具有顯著影響，冬蟲夏草在室溫水提取條件下腺苷酸(三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷)可以轉(zhuǎn)化為腺苷，腺苷可以轉(zhuǎn)化為肌苷。結(jié)論：研究結(jié)果說明了冬蟲夏草在水提過程中的腺苷轉(zhuǎn)化途徑，為冬蟲夏草腺苷類成分的質(zhì)量控制提升提供數(shù)據(jù)支持。

冬蟲夏草；腺苷；轉(zhuǎn)化途徑；高效液相

冬蟲夏草為傳統(tǒng)名貴中藥材，分布在我國青藏高原高海拔地區(qū)，其主產(chǎn)區(qū)包括西藏自治區(qū)、青海省和四川省，同時(shí)云南省和甘肅省也有小部分高原地區(qū)出產(chǎn)冬蟲夏草[1]。早在公元8世紀(jì)《月王藥診》記載其能“治肺部疾病”[2]，現(xiàn)代研究表明冬蟲夏草具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗衰老等活性[3-4]，核苷、多糖、甾醇、蛋白、多肽等物質(zhì)為其活性成分，其中核苷類成分是冬蟲夏草的重要活性物質(zhì)之一，具有提高免疫、調(diào)節(jié)心律失常、促進(jìn)血液循環(huán)等多種功效[5-8]，并被廣泛運(yùn)用于冬蟲夏草的質(zhì)量控制研究，自2000年版《中華人民共和國藥典》起就采用腺苷作為其藥材含量測(cè)定的指標(biāo)[9-12]。

前期很多學(xué)者對(duì)冬蟲夏草核苷類成分分析研究進(jìn)行了報(bào)道，采用了各種現(xiàn)代化分析手段，包括：薄層色譜法、高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳法[13-15]。通過比較前期發(fā)表結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同提取方法所測(cè)得的冬蟲夏草腺苷含量差異較大，含量高的達(dá)0.05%，含量低的只有0.01%[16-17]。楊豐慶等通過離子對(duì)色譜法對(duì)不同提取方法冬蟲夏草的核苷類成分進(jìn)行了比較分析，從分析結(jié)果推測(cè)出冬蟲夏草核苷酸、核苷之間存在著轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[18]。但對(duì)于冬蟲夏草樣本中腺苷的轉(zhuǎn)化路線尚未全面展開，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。本研究在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，建立了和腺苷相關(guān)的7種核苷類成分的定量方法，并通過比較對(duì)照品添加前后各成分的變化，闡明冬蟲夏草在提取過程中腺苷轉(zhuǎn)化的途徑，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；XS204型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；XS205型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；3K15型離心機(jī)(西格瑪奧德里奇有限公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)。

1.2 材料 三磷酸腺苷和二磷酸腺苷對(duì)照品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；單磷酸腺苷對(duì)照品(東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；腺苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院)；肌苷、腺嘌呤、次黃嘌呤對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)；對(duì)照品化合物結(jié)構(gòu)式見(圖1)。甲醇為色譜純；水為超純水；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。冬蟲夏草由東陽光藥業(yè)研究院提供，經(jīng)錢正明鑒定為冬蟲夏草。

圖1 核苷類化合物結(jié)構(gòu)式

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液配制 分別精密稱取三磷酸腺苷26.15 mg、二磷酸腺苷27.06 mg、單磷酸腺苷25.99 mg、腺苷25.20 mg、肌苷26.48 mg、次黃嘌呤25.07 mg和腺嘌呤25.15 mg，于250 mL容量瓶中，加入超純水使其溶解并定容至刻度線，搖勻，即得單一對(duì)照品溶液。移取各單一對(duì)照品溶液適量于20 mL容量瓶中，加入超純水定容至刻度線，搖勻，過0.45 μm水系濾膜，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 甲醇(90%)回流提取 稱取冬蟲夏草粉末0.3 g，精密稱定，于50 mL梨形瓶中，加入90%甲醇20 mL，密塞，搖勻，稱定重量，85 ℃下回流提取30 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取1 mL上清液，吹干，加超純水1 mL復(fù)溶，過0.45 μm水系濾膜。

2.2.2 沸水超聲提取 稱取冬蟲夏草粉末0.3 g，精密稱定，于50 mL三角瓶中，加入沸水20 mL，密塞，搖勻，室溫超聲30 min，離心，取上清液過0.45 μm水系濾膜。

2.2.3 室溫超聲提取 稱取冬蟲夏草粉末0.3 g，精密稱定，于50 mL三角瓶中，加入超純水20 mL，密塞，搖勻。室溫超聲30 min。加入磷酸100 μL，震搖3 min，離心，取上清液過0.45 μm水系濾膜。

2.2.4 添加核苷室溫超聲提取 稱取冬蟲夏草粉末0.3 g，精密稱定，于50 mL三角瓶中，加入超純水19 mL，再添加1 mL核苷單一對(duì)照品溶液，密塞，搖勻，室溫超聲30 min。加入磷酸100 μL，震搖3 min，離心，取上清液過0.45 μm水系濾膜。

2.3 色譜條件 Welch AQ-18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A為0.05 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4溶液(pH5.8)，流動(dòng)相B為0.05 mol·L-1KH2PO4-K2HPO4∶甲醇=9∶1溶液(pH 5.8)，梯度洗脫：0～14 min，0%B；14～25 min，0%～25%B；25～35 min，25%～90%B；35～40 min，90%～100%B；40～55 min，100%B；檢測(cè)波長260 nm；柱溫25 ℃；流速0.6 mL·min-1；進(jìn)樣體積5 μL。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 精密度實(shí)驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算RSD。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密稱取同一冬蟲夏草樣品6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算各成分含量的RSD值。穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一樣品供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，計(jì)算峰面積RSD值。準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：在空白溶液中加入混合對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定各成分峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD值。核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限：取含7種核苷混合對(duì)照品溶液的系列稀釋液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積數(shù)值(Y)對(duì)濃度(X，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得到三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、次黃嘌呤、單磷酸腺苷、腺嘌呤、肌苷和腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)以信噪比約為10的對(duì)照品溶液濃度為定量限。

3 結(jié)果與討論

3.1 分析條件優(yōu)化 本研究組前期已成功建立了多個(gè)冬蟲夏草核苷類成分分析方法[19-21]，但前期發(fā)表的分析方法對(duì)本次實(shí)驗(yàn)中的核苷酸類化合物分離效果較差。因此在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)分析方法又進(jìn)行了優(yōu)化。首先在前期文獻(xiàn)方法上比較了不同流動(dòng)相對(duì)化合物分離的影響，包括乙腈-水溶液系統(tǒng)、乙腈-乙酸銨溶液系統(tǒng)和甲醇-磷酸鹽溶液系統(tǒng)系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-水溶液系統(tǒng)無法將7種物質(zhì)分開，乙腈-乙酸銨溶液系統(tǒng)對(duì)ATP化合物的保留能力太弱，而甲醇-磷酸鹽溶液系統(tǒng)對(duì)ATP保留能力強(qiáng)且7種化合物能達(dá)到基線分離，因此選擇了乙腈-磷酸鹽溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相系統(tǒng)。然后比較了不同色譜柱的分離情況，包括：HILIC色譜柱、不同廠家的AQ色譜柱對(duì)7種化合物分離，結(jié)果顯示月旭AQ色譜柱對(duì)所分析的核苷類化合物具有較好的分離度，因此選擇月旭AQ色譜柱作為分離色譜柱。此外，對(duì)色譜分離的柱溫也進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25 ℃和30 ℃對(duì)化合物色譜分離影響不大，因此采用25 ℃作為分析柱柱溫。檢測(cè)波長綜合考慮前期文獻(xiàn)報(bào)道核苷類化合物檢測(cè)波長，選擇了260 nm作為檢測(cè)波長[14,18,21]。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證 按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果見表1和表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均符合要求，結(jié)果如表1所示，各成分的精密度RSD<2%，重復(fù)性RSD<10%，回收率98%～102%(RSD<2%)，12 h內(nèi)穩(wěn)定性RSD<10%。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果說明該法穩(wěn)定可靠，可用于冬蟲夏草中腺苷及其相關(guān)成分的含量測(cè)定。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率

3.3 樣品分析 精密稱取冬蟲夏草樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法，分別采用沸水超聲提取、90%甲醇回流提取和室溫超聲水提取的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，獲得冬蟲夏草不同提取方法樣品色譜圖(圖2)，并采用外標(biāo)法對(duì)相關(guān)成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

圖2 冬蟲夏草色譜圖

通過比較冬蟲夏草不同提取制備樣本中的腺苷含量，發(fā)現(xiàn)室溫超聲水提取樣本腺苷含量(0.07%)顯著高于沸水超聲提取樣本(0.03%)和90%甲醇回流提取樣本(0.03%)，由此可以推測(cè)在室溫超聲提取過程中可能有其他成分向腺苷的轉(zhuǎn)化，而在沸水或90%甲醇的條件下該轉(zhuǎn)化途徑被抑制。進(jìn)一步比較室溫超聲提取樣本和沸水超聲提取樣本中其他成分的含量，發(fā)現(xiàn)肌苷含量在室溫超聲提取樣本中(0.06%)比沸水超聲提取樣本中(0.02%)高，而二磷酸腺苷和單磷酸腺苷僅在沸水超聲提取樣品含有，因此可以推測(cè)在室溫超聲提取條件下二磷酸腺苷和單磷酸腺苷可能轉(zhuǎn)化為了腺苷和肌苷。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)選室溫水超聲為提取條件，采用添加對(duì)照品的方法逐個(gè)驗(yàn)證化合物間的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，通過比較添加三磷酸腺苷冬蟲夏草室溫超聲提取樣本和未添加三磷酸腺苷樣本中各化合物的含量，發(fā)現(xiàn)添加的三磷酸腺苷未被檢測(cè)到，而腺苷和肌苷的含量有顯著的增加，該現(xiàn)象證實(shí)了在室溫超聲水提取的條件下存在三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為腺苷和肌苷的途徑。通過添加二磷酸腺苷和單磷酸腺苷對(duì)照品的實(shí)驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)了同樣的情況，樣本中添加的二磷酸腺苷和單磷酸腺苷均未被檢測(cè)到，而腺苷和肌苷的含量有顯著增加，說明在實(shí)驗(yàn)條件下存在著二磷酸腺苷和單磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為腺苷和肌苷的途徑。通過添加腺苷提取實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)樣本中腺苷含量和肌苷含量均有明顯增加，說明腺苷在實(shí)驗(yàn)條件下可以部分轉(zhuǎn)化為肌苷。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果(圖3)驗(yàn)證了前期文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)冬蟲夏草室溫水提取條件下，存在著單磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為腺苷，腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷的結(jié)論[18]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了在室溫水提條件下還存在三磷酸腺苷和二磷酸腺苷向腺苷的轉(zhuǎn)化。

圖3 冬蟲夏草室溫水提取過程中腺苷類成分轉(zhuǎn)化路徑圖

表3 核苷添加試驗(yàn)冬蟲夏草樣本中各分析物的含量

4 小結(jié)

我們建立了一種同時(shí)測(cè)定冬蟲夏草中7種核苷類成分的分析方法，并采用所建立的分析方法對(duì)添加核苷對(duì)照品前后的冬蟲夏草樣本溶液中核苷含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示在室溫水超聲提取條件下冬蟲夏草水溶液中存在著腺苷酸(三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和單磷酸腺苷)向腺苷的轉(zhuǎn)化，腺苷向肌苷的轉(zhuǎn)化，該結(jié)果將為冬蟲夏草腺苷類成分的質(zhì)量控制提升提供數(shù)據(jù)支持。

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(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Adenosine transformation pathway during water extraction of Chinese Cordyceps

Qian Zhengming1，Zhen Daming1，Li Wenqing1，Li Wenjia1，Sun Mintian1，Yang Fengqing2，Xiang Li3

(1SunShineLakePharmCo.，Ltd，Donguan523850，China; 2SchoolofChemistryChemicalEngineering，Chongqing400030，China； 3InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective:To clarify the transformation pathway of adenosine during water extraction of Chinese Cordyceps.A HPLC method for simultaneous determination of seven nucleosides(adenosine triphosphate，adenosine diphosphate，adenosine monophosphate，adenosine，inosine，hypoxanthine and adenine)in Chinese Cordyceps was developed.By comparing the change of nucleosides’ contents before and after adding of standards，it was found that adenylate(adenosine triphosphate / adenosine diphosphate / adenosine monophosphate)can be transformed into adenosine，and adenosine can be transformed into inosine at room temperature water extraction condition.

Chinese Cordyceps; Adenosine; Transformation pathway; HPLC

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項(xiàng)——中藥飲片質(zhì)量保障體系研究(一)(編號(hào)：201507002)，負(fù)責(zé)人：李文佳

李文佳，主要研究方向：中藥資源與開發(fā)，E-mail：LiWenjia@hecpharm.com

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.002