朱金霞，張?jiān)磁妫崌?guó)保，孔德杰，李 苗

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002)

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利用酶標(biāo)儀快速批量測(cè)定橡膠草中菊糖的含量

朱金霞，張?jiān)磁?，鄭國(guó)保，孔德杰，李 苗

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002)

以橡膠草根為研究對(duì)象,采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法),利用酶標(biāo)儀為檢測(cè)儀器,建立了橡膠草中菊糖的快速測(cè)定方法。結(jié)果表明,酶標(biāo)儀檢測(cè)橡膠草根中總糖和還原糖含量的最佳實(shí)驗(yàn)條件:波長(zhǎng)為550 nm、DNS顯色劑用量為0.8 mL、沸水浴顯色時(shí)間為8 min。同時(shí),獲得此條件下回歸方程為A=0.6872C-0.0215(R2=0.9982),線性范圍為0～2.2 mg/mL,加樣回收率為96.67%～102.33%。該方法靈敏、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好,可在短時(shí)間內(nèi)完成多個(gè)樣品同時(shí)測(cè)定,該方法所得結(jié)果略高于分光光度計(jì)法。

酶標(biāo)儀,3,5-二硝基水楊酸(DNS)法,橡膠草,菊糖

橡膠草(Taraxacumkok-saghyzRodin,TKS)為菊科(Compositae)蒲公英屬多年生宿根草本植物,外形與蒲公英非常相似,又被稱為俄羅斯蒲公英,但其根部含有天然橡膠[1],俗稱橡膠草[2]。橡膠草除含膠乳外,還含有纖維素、菊糖等成分[3],因此,從橡膠草不但可獲得戰(zhàn)略資源橡膠,還可生產(chǎn)清潔能源乙醇和保健品菊糖。近年來,作為一種重要的巴西橡膠樹替代作物、可再生能源植物及保健品開發(fā)植物,引起了各國(guó)專家的廣泛關(guān)注和研究[3]。

菊糖多存在于菊科、龍膽科、桔?？频戎参镏?主要是由D-呋喃果糖經(jīng)1,2-糖苷鍵聚合而成的一種果聚糖,呈直鏈結(jié)構(gòu),其還原性末端連有一分子葡萄糖,每個(gè)菊糖分子約含30～50個(gè)果糖殘基,植物中所含菊糖均為多種不同聚合度果聚糖的混合物[4]。菊糖具有水溶性膳食纖維和生物活性前體的生理功能,因而廣泛應(yīng)用于低熱量、低糖、低脂食品中,具有多種保健功能和優(yōu)良的食用價(jià)值,作為新型食品添加劑而受到國(guó)內(nèi)外的高度重視[5-6]。資料報(bào)道[7],橡膠草根中菊糖占干重的40%左右,但其具體測(cè)定方法未見報(bào)道。

DNS比色法是測(cè)定還原糖的經(jīng)典方法,得到了國(guó)內(nèi)外研究者的普遍認(rèn)可[8],實(shí)驗(yàn)中一般采用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[9-10],由于受到比色槽數(shù)量的限制,一次最多能測(cè)定4個(gè)樣品,操作較繁瑣,測(cè)定多個(gè)樣品時(shí),費(fèi)時(shí)費(fèi)力。酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)的測(cè)試原理相同,但具有樣品槽多(96個(gè))的特點(diǎn),可在2 min內(nèi)進(jìn)行多波段多個(gè)樣品的測(cè)定。本研究利用酶標(biāo)儀為測(cè)試儀器,以果糖為標(biāo)準(zhǔn)品,以DNS溶液為顯色劑,通過測(cè)定總糖水解液及還原糖提取液中的還原糖含量,進(jìn)而獲得菊糖含量。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法靈敏、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好,可在2 min內(nèi)完成96個(gè)樣品的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橡膠草 2013年從俄羅斯引進(jìn),在寧夏銀川市賀蘭縣橡膠草種質(zhì)馴化基地種植,以一年生橡膠草的根為實(shí)驗(yàn)材料。

結(jié)晶酚,亞硫酸氫鈉,酒石酸鉀鈉,氫氧化鈉,3,5-二硝基水楊酸,果糖,鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純。

伯樂Bio-rad xMark酶標(biāo)儀 時(shí)代聯(lián)想生物科技有限公司;Avanti J-26s×P臺(tái)式離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司;HH-6電熱恒溫水浴鍋 無錫沃信儀器有限公司;DHG9013AS電熱鼓風(fēng)干燥箱 寧波艾德生儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制方法及濃度 DNS顯色溶液的配制方法見參考文獻(xiàn)[11];果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.0 mg/mL,配制方法見參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.2 還原糖含量的測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測(cè)定還原糖供試溶液及總糖降解后溶液中還原糖的含量。

1.2.3 橡膠草預(yù)處理 預(yù)處理流程如下:新鮮橡膠草根→洗凈→烘干(60 ℃,48 h)→粉碎(過60目)。

1.2.4 測(cè)試溶液的制備 還原糖供試溶液制備流程如下:稱取預(yù)處理后樣品粉末1.0 g→加25 mL蒸餾水→熱浸(沸水浴)30 min→過濾→濾液定容于1000 mL→DNS溶液顯色5 min→酶標(biāo)儀測(cè)定糖含量?？偺枪┰嚾芤褐苽淞鞒倘缦?稱取預(yù)處理后樣品粉末1.0 g→加入25 mL的2.0%鹽酸溶液→熱浸(沸水浴)30 min→調(diào)pH于7.0→脫色→過濾→濾液定容于1000 mL→DNS溶液顯色5 min→酶標(biāo)儀測(cè)定糖含量。

1.2.5 取樣 對(duì)酶標(biāo)板96個(gè)微孔進(jìn)行編號(hào),并移取250 μL待測(cè)試溶液于酶標(biāo)板的微孔中,每個(gè)微孔可移取一個(gè)測(cè)試樣品,最多一次可添加96個(gè)樣品溶液,進(jìn)行同時(shí)測(cè)試。

1.3 測(cè)定條件的確定

1.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、還原糖和總糖供試溶液1.0 mL,經(jīng)DNS溶液顯色5 min后,分別在200～1000 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)其吸光度值。

1.3.2 DNS顯色時(shí)間的確定 果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL,加入DNS顯色溶液,分別反應(yīng)2、4、6、8、10、12、14 min后,以DNS顯色劑調(diào)零,在一定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.3.3 DNS用量的確定 果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL,分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的DNS溶液顯色后,以DNS顯色劑調(diào)零,在一定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.4 樣品測(cè)定方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,加蒸餾水至2.0 mL,搖勻,經(jīng)顯色反應(yīng)后。在一定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,以糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 樣品的顯色及測(cè)定 準(zhǔn)確吸取上述供試溶液1.0 mL于25 mL的具塞試管中,加入DNS顯色劑1.0 mL,搖勻,沸水浴中熱浸顯色5 min,迅速用自來水冷卻至室溫,再加入9.0 mL蒸餾水,在一定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。根據(jù)對(duì)照品溶液的回歸方程計(jì)算糖含量。

菊糖含量(g)=總糖含量(g)-還原糖含量(g);

菊糖提取率(%)=菊糖含量(g)/試樣重量(g)×100。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取還原糖供試溶液、總糖供試溶液各1.0 mL,經(jīng)顯色反應(yīng)后,分別放置0、0.5、1.0、1.5、2.0、12.0 h后進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取0.5 mL總糖供試溶液于6支試管中,各精密加入0.3 mL和0.6 mL的果糖對(duì)照品溶液,并分別用蒸餾水稀釋至2 mL,搖勻,經(jīng)顯色反應(yīng)后,在一定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

利用excel 2003作圖,利用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品溶液在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下吸光度值的變化規(guī)律

將標(biāo)準(zhǔn)溶液、還原糖溶液、總糖溶液和空白對(duì)照溶液分別與DNS試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)后,在文獻(xiàn)報(bào)道[11-14]的常規(guī)波長(zhǎng)(480～600 nm)范圍內(nèi)進(jìn)行多波段掃描,不同溶液的吸光度值經(jīng)空白對(duì)照溶液調(diào)零后,結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下各溶液吸光度值的變化規(guī)律Fig.1 The absorbance of different solvent under different detection wavelength

表1 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及菊糖的提取率

Table 1 Regression equations,correlation coefficient and the content of the inulin under different wavelength

檢測(cè)波長(zhǎng)(nm)回歸方程相關(guān)系數(shù)菊糖提取率均值(%)480A=13989C-01390R2=095764456EF490A=13442C-00890R2=098274365I500A=12336C-00543R2=099244410H510A=11057C-00386R2=099554429G520A=09840C-00290R2=099694433G530A=08594C-00227R2=099754492CD540A=07376C-00183R2=099784465E550A=06872C-00215R2=099824487D560A=05357C-00122R2=099814487D570A=04506C-00110R2=099784561A580A=03812C-00088R2=099814452F590A=03137C-00080R2=099784498C600A=02596C-00064R2=099804528B

注:菊糖提取率均值數(shù)據(jù)后大寫字母相同表示在p<0.01水平無極顯著差異。從圖1中可看出,在整個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)零后的吸光度值隨著檢測(cè)波長(zhǎng)的增大呈顯著下降趨勢(shì),數(shù)值介于0.256～1.258之間。還原糖和總糖溶液調(diào)零后的吸光度值變化不大,數(shù)值分別介于0.028～0.147和0.490～0.610之間。波長(zhǎng)低于520 nm和高于590 nm時(shí),空白對(duì)照溶液有較強(qiáng)的紫外吸收,這是由于顯色劑本身具有顏色而獲得的吸光值,這將會(huì)影響顯色液吸光值的可靠性,因此分析波長(zhǎng)應(yīng)選擇在530～580 nm之間,可避開顯色劑本身對(duì)分析結(jié)果的干擾[12]。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

對(duì)顯色后的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行多波段(100～1000 nm)掃描,然后選擇干擾小,吸收較強(qiáng)的波長(zhǎng)(480～600 nm)范圍內(nèi)進(jìn)行每10 nm單位掃描一次,記錄吸光度值。以果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),以吸光度值為縱坐標(biāo),繪制不同波長(zhǎng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行回歸分析,計(jì)算不同波長(zhǎng)條件下菊糖提取率,結(jié)果如表1所示。

從表1中數(shù)據(jù)可看出,當(dāng)果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0～2.2 mg/mL范圍內(nèi),檢測(cè)波長(zhǎng)為480～600 nm時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系均良好,計(jì)算得到其相應(yīng)菊糖含量介于43.65%～45.61%之間。經(jīng)方差分析,不同檢測(cè)波長(zhǎng)條件下的菊糖含量,部分測(cè)試結(jié)果之間呈極顯著差異,p<0.01。因此在檢測(cè)時(shí)選擇不同的檢測(cè)波長(zhǎng),對(duì)最終菊糖含量的測(cè)定結(jié)果影響較大。但在本實(shí)驗(yàn)中,考慮到檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm時(shí),其線性相關(guān)系數(shù)最高,確定本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm。

2.3 顯色時(shí)間的確定

3,5-二硝基水楊酸(DNS)與還原糖共熱一定時(shí)間,可被還原成紅棕色氨基化合物,共熱時(shí)間的長(zhǎng)短不同可影響生成的紅棕色氨基化合物的量,進(jìn)而影響吸光度值,結(jié)果如圖2中所示。

圖2 不同顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響Fig.2 The effect of the reaction timeon the figure of the absorbance

在檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm時(shí),顯色時(shí)間為2～14 min內(nèi),不同樣品溶液其吸光度值變化趨勢(shì)不同。顯色反應(yīng)時(shí)間較短(2～6 min)時(shí),隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,其吸光度值迅速增大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)于8 min時(shí),其吸光度值保持一個(gè)較平穩(wěn)的水平。這是由于較短的顯色反應(yīng)時(shí)間,化學(xué)反應(yīng)不完全,生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸有限,使得紫外吸收較弱。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),顯色時(shí)間超過8 min時(shí),化學(xué)反應(yīng)發(fā)生較徹底,生成物的量基本保持不變,所以吸光度值變化不大。

2.4 DNS試劑用量的確定

DNS試劑用量與待測(cè)液中還原糖反應(yīng)的是否完全,對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響顯著,結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同DNS用量對(duì)吸光度值的影響Fig.3 The effect of absorption on different DNS dosage

當(dāng)DNS試劑用量小于0.8 mL時(shí),溶液吸光度隨DNS量的增加而迅速增大,當(dāng)DNS試劑用量大于0.8 mL時(shí),吸光度值則基本保持不變。因此,在考慮到節(jié)省能源及保護(hù)環(huán)境的情況下,DNS試劑的最佳用量為0.8 mL。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

不同種類溶液進(jìn)行穩(wěn)定性考察,對(duì)全面掌握溶液的穩(wěn)定性,具有重要的參考意義,結(jié)果如圖4所示。

從圖4中可看出,三種測(cè)試溶液在顯色后,放置2 h內(nèi),測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定,數(shù)值幾乎沒有變化。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),當(dāng)放置時(shí)間達(dá)到12 h時(shí),其吸光度值迅速降低,因此進(jìn)行大批量樣品的還原糖含量測(cè)定時(shí),可將放置2 h內(nèi)顯色液樣品集中測(cè)定以提高工作效率。

圖4 測(cè)試溶液顯色后放置時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Fig.4 The effect of absorbance on storage time after color reaction

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

由表2可看出,果糖平均回收率為99.61%,RSD值為2.08%。因此,在此條件下進(jìn)行測(cè)定時(shí),結(jié)果是可靠的。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 2 The results of recovery test

總糖樣品量(mg)加入量(mg)測(cè)定值(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0239030005299667023903000541100670239030005339800023906000834991702390600084410038023906000853102339961208

2.7 酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)對(duì)橡膠草根中菊糖含量測(cè)試結(jié)果的比較

分別利用酶標(biāo)儀和紫外分光光度計(jì),測(cè)試同一批次的橡膠草根,菊糖百分含量如表3所示。

表3 酶標(biāo)儀和分光光度計(jì)測(cè)定橡膠草根中菊糖的測(cè)試結(jié)果比較

Table 3 The results of insuls in the root ofTaraxacumkok-saghyzRodin

編號(hào)菊糖含量(%)酶標(biāo)儀比色法分光光度計(jì)比色法148574686248394611347454799449134755548014624649324715平均值48484698

從表3中數(shù)據(jù)可看出,不同測(cè)試儀器對(duì)同一樣品的測(cè)試結(jié)果不同,酶標(biāo)儀的測(cè)試結(jié)果略高于分光光度計(jì)。

3 結(jié)論與討論

菊糖廣泛分布于菊科、龍膽科、桔?？频葘俚闹参镏?橡膠草也為菊科植物,雖然有研究報(bào)道,橡膠草中含有菊糖,但到目前為止,沒有進(jìn)行橡膠草中菊糖含量測(cè)定的報(bào)道。通過此項(xiàng)研究,建立了橡膠草根中菊糖含量的快速和批量的測(cè)定方法,確定了其根中菊糖含量約為46.98%。

在諸多還原糖測(cè)定方法中,DNS比色法因其方便、快捷的特點(diǎn)而被廣泛采用[9],但實(shí)驗(yàn)中一般采用紫外-分光光度計(jì)為測(cè)定儀器,由于其樣品槽的有限,在批量和多波長(zhǎng)測(cè)定時(shí),所用時(shí)間較長(zhǎng),操作步驟繁瑣,極大地影響了其工作效率。本研究所用的酶標(biāo)儀,其測(cè)定原理與分光光度計(jì)相同,在合適的波長(zhǎng)(200～1000 nm)范圍內(nèi),均能達(dá)到良好的測(cè)定效果。本實(shí)驗(yàn)中所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2最高可達(dá)0.9982,所得結(jié)果可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

DNS法測(cè)定還原糖含量時(shí)波長(zhǎng)的選擇對(duì)測(cè)定結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。文獻(xiàn)中報(bào)道480[14]、500[15]、520[16]、530[17]、540[13,18]、550 nm[19]等波長(zhǎng)均可作為測(cè)定波長(zhǎng)。但是由于被測(cè)試溶液的特殊性及干擾因素的差異性,導(dǎo)致所選波長(zhǎng)的不確定性。本研究掃描了480～600 nm波長(zhǎng)下不同樣品的吸光度值,發(fā)現(xiàn)總糖溶液和還原糖溶液在490～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸光度值的變化趨勢(shì)較一致,對(duì)菊糖測(cè)定結(jié)果有一定影響。但考慮到標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2,最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm。

總糖溶液的提取采用的是鹽酸溶液與固體樣品一起加熱,提取過程中,可能存在樣品中一些可溶性纖維素和淀粉的水解,導(dǎo)致測(cè)定的總糖量較高,進(jìn)而影響最終菊糖含量及提取率的數(shù)據(jù)。但這種提取方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度,尚待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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Rapid batch determination of the inulin inTaraxacumkok-saghyzRodin by enzyme mark instrument

ZHU Jin-xia,ZHANG Yuan-pei*,ZHENG Guo-bao,KONG De-jie,LI Miao

(Agricultural Biotechnology Center of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Yinchuan 750002,China)

Inordertoestablishtherapidbatchdeterminationmethod,whichcouldbeusedinthedeterminationoftheinulininTaraxacum kok-saghyzRodinrootbyenzymemarkinstrument,3,5-dinitrosalicylicAcidColorimetry(DNS)wasusedasthemainlymethods.Theresultsshowedthattheoptimumconditionsasfollows,thewavelengthwas550nm,thevolumeofcolorsolutionwas0.8mL,thecolorationtimewas8min.Underthiscondition,thecalibrationcurveofthismethodhadalinerrangefrom0to2.2mg/mLwitharegressionequationofA=0.6872C-0.0215(R2=0.9982),andthespottingrecoveryratewasfrom96.67%to102.33%.Themethodwassensitive,stableandreproducibilitytooperate,anditwassuitabletobeusedforrapidlyandquantitativelyanalysisofinulininTaraxacum kok-saghyzRodin.TheresultsoftheinulininTaraxacum kok-saghyzRodin,whichhadbeendetectedbyenzymeismorehigherthanbyspectrophotometry.

enzymemarkinstrument;3,5-dinitrosalicylicAcidColorimetry(DNS);Taraxacum kok-saghyzRodin;inulin

2016-04-01

朱金霞(1977-)，女，碩士，副研究員，主要從事植物資源與生物化學(xué)方面研究，E-mail:jinxiazhu001@163.com。

*通訊作者:張?jiān)磁?1968-)，男，博士，研究員，主要從事植物資源與生物化學(xué)方面研究，E-mail：zhangypei@163.com。

國(guó)家科技部國(guó)際合作項(xiàng)目 (2014DFR31020)；寧夏回族自治區(qū)科技支撐對(duì)外合作項(xiàng)目。

TS241

A

1002-0306(2016)19-0294-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.048