李智麗，黃淑堅(jiān)，馬靜云，畢英佐

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

2011—2015年我國南方地區(qū)PEDV分子流行病學(xué)調(diào)查及S基因遺傳變異分析

李智麗1，黃淑堅(jiān)1，馬靜云2，畢英佐2

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

應(yīng)用RT-PCR方法對南方地區(qū)五?。◤V東、廣西、福建、四川、江蘇）18個豬場7日齡以內(nèi)發(fā)病仔豬的小腸組織和糞便樣本進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒（PEDV）檢測，對9個豬場進(jìn)行為期5年的動態(tài)監(jiān)控，并對2011—2015年期間分離的35個PEDV流行株的S基因進(jìn)行測序，與GenBank中的PEDV參考序列進(jìn)行比較，并繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，上述地區(qū)五省存在Group1和 Group 2兩種類型毒株。Group1與美國、韓國毒株較為接近，可分為G1-1、G1-2、G1-3 和G1-4等4個亞群，Group 2與2004年國內(nèi)分離毒株較為接近，可分為G2-1、G2-2兩個亞群。25個中國南方地區(qū)毒株集中于 G1-2 和 G1-3，而另外8株與2004年國內(nèi)毒株（JS-2004-2）同屬G2-2亞群。不同類型的毒株引發(fā)的PEDV臨床表現(xiàn)及死亡率不同，G2-2亞群的毒株引發(fā)的PED相對緩和，死亡率較低且病程較短，而位于G1-2和G1-3亞群（尤其是G1-3）的毒株則引起大規(guī)模急性暴發(fā)，病程較長，死亡率較高。

豬流行性腹瀉病毒；動態(tài)監(jiān)控；S基因；遺傳變異

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹瀉、嘔吐、脫水及哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染?。?］。PED 于1971年首次報(bào)道，并于1978年從患病豬的病料中分離出該病病原［2-3］。該病主要發(fā)生于歐洲養(yǎng)豬國家和東南亞養(yǎng)豬國家［4-5］。2008年有報(bào)道PEDV 在我國免疫豬群中流行［6］。2010年10月我國暴發(fā)PED疫情，發(fā)病范圍廣，呈急性發(fā)生，發(fā)病率為80%～100%，死亡率在50%以上［7-9］。截至目前，PEDV在中國、韓國、美國、越南、泰國、匈牙利、臺灣、加拿大、法國、美國等多個國家和地區(qū)均有報(bào)道［10-17］，PEDV給全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronviridae）冠狀病毒屬（Coronavims）成員。該病毒呈多形性，病毒顆粒直徑約95～190 nm，平均直徑（包括纖突）約為130 nm，表面有囊膜，囊膜上有花瓣?duì)罾w突，長約18～23 nm［18-19］。PEDV是有囊膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其基因組大小約為28 kb，5'端為含有帽子結(jié)構(gòu)的非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），3'端為含有多聚腺苷酸尾巴（poly A）的非翻譯區(qū)，全基因組編碼至少7個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），相鄰基因之間存在間隔序列［19-21］。S基因、E基因、M基因和N基因分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白［20-21］。其中，S 基因編碼S（spike）蛋白，由1 383個氨基酸組成，分子質(zhì)量為180～220 ku，是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，在病毒粒子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過膜融合侵入宿主細(xì)胞，在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用［22-24］。研究表明，S基因在分析PEDV流行性毒株的遺傳變異中發(fā)揮重要作用，是序列比對中所用的重要基因［5，25］。PEDV S基因的1 495～1 914 bp含有主要的中和介導(dǎo)抗原決定部位，稱為COE片段，而COE片段存在大量抗原決定簇，是作為重組載體較為重要的基因，核苷酸全長為420 bp，編碼140個氨基酸，在這個序列區(qū)內(nèi)所發(fā)生的點(diǎn)突變可能會使相關(guān)的單克隆抗體失效［26-28］。

本研究對我國南方地區(qū)五?。◤V東、廣西、福建、四川、江蘇）18個豬場7日齡以內(nèi)發(fā)病仔豬的小腸組織和糞便樣本進(jìn)行PEDV檢測，對9 個暴發(fā)PEDV的豬場感染情況進(jìn)行深入調(diào)查，積累了大量的流行病學(xué)材料。對此次疫情的暴發(fā)特征、病毒排毒規(guī)律及不同豬群發(fā)病規(guī)律進(jìn)行分析，并對2011—2015年期間分離的35個PEDV流行株的S基因進(jìn)行測序，同時對COE片段進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹將S基因與GenBank中的PEDV參考序列進(jìn)行分析比較，為探討當(dāng)前我國PED發(fā)生規(guī)律以及制定有效防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集與處理

采集我國南方地區(qū)五?。◤V東、廣西、福建、四川、江蘇）18個豬場7日齡以內(nèi)發(fā)病仔豬的小腸組織和糞便樣本，并挑選9個規(guī)?；i場進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)控，記錄2011年1月—2015年6月的發(fā)病率、死亡率及臨床癥狀。取腸道組織或糞便組織置于預(yù)冷的無菌研磨器中，加入3 mL DMEM（含400 U/mL青霉素、200 μg/mL鏈霉素），反復(fù)研磨至糊狀，然后置于-80℃冰箱中迅速冷凍，再迅速置于37℃溫水中融化，如此反復(fù)凍融3次，10 000 g離心20 min，上清液用孔徑0.22 μm的濾器過濾除菌，糞便樣品加入1 mL DMEM直接震蕩5 min，10 000 g離心5 min，取上清液用于RT-PCR檢測。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑、PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2、Trizol Reagent、Ex Taq、dNTP Mixture、pMD19-T Vector、dNTPs（2.5 mmol/L）、DL2000? DNA Marker和6×Loading Buffer均購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司（TaKaRa公司）。DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞自制。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

參照GenBank中的PEDV毒株CV777株和Brl/87株基因序列的S基因序列，針對基因保守區(qū)利用Oligo 7.0設(shè)計(jì)引物（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴(kuò)增的目的片段大小約4 200 bp。

表1 引物名稱、序列及長度

1.4 S基因擴(kuò)增

病毒RNA提取按照實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)常規(guī)操作進(jìn)行。然后參照PrimeScript? One Step RTPCR Kit Ver.2產(chǎn)品說明書配制RT-PCR反應(yīng)液，反應(yīng)程序如下：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃ 預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s，30個循環(huán)，RT-PCR產(chǎn)物直接用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和回收。參照Omega公司的膠純化試劑盒說明書對RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化；將回收產(chǎn)物按照10 μL連接反應(yīng)體系于4℃下連接過夜，將連接產(chǎn)物5 μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞50 μL，于37℃下培養(yǎng)過夜。對平板中的陽性菌落進(jìn)行篩選、鑒定，選擇經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

1.5 S基因的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAStar、CLUSTALX v1.83比對，采用MegAlign software（MEGA，version5.0）基因序列軟件的 Clustal W計(jì)算方法進(jìn)行序列分析，采用常用的臨位相接法（Neighbor-joining法）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建并以Bootstrap驗(yàn)證進(jìn)化樹的可信度，分別對35株流行毒株S基因進(jìn)行測定，并與GenBank中調(diào)出的參考序列（表2）進(jìn)行比對，分析彼此間的相似性、遺傳進(jìn)化關(guān)系及變異程度，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過網(wǎng)站 http：//tools.immuneepitope.org 對S蛋白中的COE片段進(jìn)行抗原位點(diǎn)預(yù)測；通過網(wǎng)站 http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 對COE片段進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV感染豬場的臨床表現(xiàn)

對9個豬場的監(jiān)控結(jié)果可知，PEDV全年均有發(fā)生（圖1），但仔豬的死亡率有所差異，2011—2012年死亡率為50%～100% ，2013年的死亡率最低，2014—2015年則有增加趨勢，死亡率為0～30%，死亡率最高發(fā)生在2011年2月，9個豬場仔豬死亡數(shù)量達(dá)到12 000頭。PEDV對懷孕母豬的影響較大而對育肥豬的影響最小，其中，懷孕母豬、哺乳母豬、保育豬和育肥豬的發(fā)病率為20%～80%，臨床表現(xiàn)為沮喪、食欲不振、腹瀉等，死亡率較低甚至沒有死亡（圖2）。

圖1 2011—2015年9個規(guī)?；i場仔豬死亡情況

表 2 本研究所用序列及參考序列信息

圖2 2011年9個規(guī)?；i場懷孕母豬、哺乳母豬、保育豬和育肥豬的發(fā)病情況

2.2 S基因變異分析

將35株臨床分離的PEDV的S基因測序結(jié)果上傳至GenBank，其S基因序列長度為4 152～4 161 bp，編碼 1 384～1 387個氨基酸，其中有4個毒株（CH-SHT-12- 2011、CH-STC-12-2012、CH-HKC-08-2011、CHGMB-02-2013）與疫苗株CV777相比有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，在163位有1個氨基酸（N）插入，并有 58 個氨基酸變異，變異率為 4.18%；而另外的31株流行株在59～62位有4個氨基酸（QGVN），在140位有1個氨基酸（N）插入，96個氨基酸變異，變異率為6.92%。這些變異情況與美國毒株（PC21A、IA1、MEX-104-2013和USA-Colorado30-2013）和臺灣毒株（TWChiayi-32）一致，并且與韓國在2011年分離的流行株（CNU-091222-01 和 CNU-091222-02）的變異情況一致。

與經(jīng)典毒株CV777（疫苗株）相比，流行株的COE片段核苷酸變化最大的位置位于1 586～1 617 bp和1 802～1 874 bp（氨基酸位置分別是527～539和600～625）。在PEDV流行毒株的COE片段序列中存在4個B細(xì)胞抗原表位區(qū)，分別為其推導(dǎo)氨基酸序列中第4～10位的PSFNDHS，第55～69位的NVTNSYGYVSKSQDS，第76～83位的QSVNDYLS以及第129～134位的GTPKP（圖3）。COE片段氨基酸序列的糖基化位點(diǎn)預(yù)測位于COE推導(dǎo)氨基酸序列的第13位與第55位，即S蛋白中的第511位與第533位中均存在兩個高度保守的糖基化位點(diǎn)，分別為NIT與NVT（圖4）。

圖3 COE片段B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

圖4 S基因COE片段糖基化位點(diǎn)的預(yù)測

2.3 S基因遺傳進(jìn)化分析

構(gòu)建S基因遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果（圖5）表明，PEDV存在兩種類型毒株，分別為Group1和Group 2。Group1與美國、韓國毒株較為接近，可分為4個亞群G1-1、G1-2、G1-3 和G1-4；G1-1亞群包含7個美國流行毒株、5個臺灣流行毒株和2個中國南方地區(qū)毒株，G1-2亞群包括15個南方地區(qū)毒株，4個國內(nèi)毒株及兩個美國毒株，G1-3亞群包括10個南方地區(qū)毒株和2個國內(nèi)毒株，G1-4亞群包括1個韓國毒株和1個中國毒株?？梢?，G1-2亞群包含的毒株大部分是2012—2015年分離的，而G1-3 亞群則主要包含了2011年國內(nèi)分離的毒株。Group 2與2004年分離的毒株較為接近，可分為G2-1、G2-2兩個亞群。其中G2-1亞群主要包含早期毒株及疫苗株，而G2-2亞群則包含了2004年國內(nèi)毒株（JS-2004-2）和8株南方地區(qū)流行株。

圖5 35株中國南方地區(qū)PEDV毒株及參考序列的S基因遺傳進(jìn)化樹

2.4 S基因同源性分析

35株臨床分離的PEDV的S基因之間同源性為93.0%～100%，與參考序列的同源性為92.4%～99.0%； Group1的序列之間同源性為97.5%～100%，與Group2相比同源性為93.7%～95.9%；G2-2亞群中的8個毒株與2004年國內(nèi)毒株（JS-2004-2）同源性較高，而與其余27個南方地區(qū)毒株（位于G1-2和G1-3亞群）相比同源性較低、為94.8%～95.7%；G1-2和G1-2亞群的序列同源性為97.9%～98.7%。

值得關(guān)注的是，不同類型的毒株引發(fā)的PEDV臨床表現(xiàn)及死亡率不同，G2-2亞群的毒株引發(fā)的PED相對緩和，死亡率較低且病程較短，而位于G1-2和G1-3亞群（尤其是G1-3）的毒株則引起大規(guī)模急性暴發(fā)，病程較長，死亡率較高。

3 結(jié)論與討論

本研究對南方五省18個豬場7日齡以內(nèi)發(fā)病仔豬的小腸和糞便樣本進(jìn)行了PEDV檢測，對其中9個豬場進(jìn)行為期5年的動態(tài)監(jiān)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PED全年均有發(fā)生，有一定規(guī)律性，但仍不明顯。 2011—2012年死亡率為50%～100%，而2014—2015年死亡率為0～30%，2013年的死亡率最低，而2014—2015年有增加趨勢。PEDV對懷孕母豬的影響較大而對育肥豬的影響最小，建議開展各階段尤其是懷孕母豬體內(nèi)的PEDV抗體監(jiān)控，進(jìn)而為PEDV的防控提供科學(xué)指導(dǎo)。國外學(xué)者也認(rèn)為應(yīng)當(dāng)采取科學(xué)措施合理管理懷孕母豬以便減少仔豬的發(fā)病率和死亡率［20］。

本研究對2011—2015年期間分離的35個PEDV流行株的S基因進(jìn)行測序，其中有4個毒株（CH-SHT-12- 2011、CH-STC-12-2012、CH-HKC-08-2011 和 CH-GMB-02-2013）與疫苗株CV777相比有獨(dú)特的特征，變異率為4.18%，而另外的31株流行株變異率為6.92%，且這些變異情況與美國毒株（PC21A、IA1、MEX-104-2013 和USA-Colorado30-2013）、臺灣毒株（TW-Chiayi-32）及韓國在2011年分離的流行株（CNU-091222-01 和CNU-091222-02）一致［5，11，15，17，29-30］。

通過構(gòu)建S基因遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，PEDV存在兩種類型毒株，分別為Group1和 Group 2，其中31株流行株歸于Group1，與美國、韓國毒株同源關(guān)系較為接近，具有同源性意義；CH-SHT-12-2011、CH-STC-12-2012、CHHKC-08-2011和 CH-GMB-02-2013歸于Group 2，與2004年分離毒株同源關(guān)系較為接近。且兩種類型的毒株引發(fā)的PEDV臨床病死率不同，Group1的毒株引起的PEDV呈大規(guī)模急性暴發(fā)，病程較長，死亡率較高；Group 2的毒株引發(fā)的PEDV呈緩和型暴發(fā)，死亡率相對較低且病程較短?？梢姳狙芯恐?1株毒株為世界范圍內(nèi)流行株，而其余4個毒株呈地方性流行，與早期分離毒株較為接近。

我國南方地區(qū)PEDV流行毒株S蛋白中的第511位與533位中均存在兩個高度保守的糖基化位點(diǎn)，分別為NIT與NVT，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［31］。糖基化是影響抗原的免疫原性、誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的一個重要原因。對我國南方地區(qū)PEDV流行毒株COE片段B細(xì)胞抗原表位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，與Chinju99株存在差異，南方地區(qū)毒株的COE片段僅有4個B細(xì)胞抗原表位區(qū)，有別于Chinju99的6個B細(xì)胞抗原表位區(qū)［26，32］。這些突變位點(diǎn)是否能引起毒株毒力改變?nèi)孕枰M(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果揭示我國主要流行的PEDV野毒株不同于疫苗株（DRl3、CV777），可逃避目前國內(nèi)外傳統(tǒng)的常規(guī)疫苗免疫，但我國同時又存在經(jīng)典毒株，使得我國PEDV野毒株遺傳變異的復(fù)雜性更大［8-9，22-23］，加劇了臨床防控的難度。因此對PEDV的長期監(jiān)控及抗體檢測需加強(qiáng)，并從發(fā)病原因、病原變異規(guī)律、免疫方式上進(jìn)一步深入研究。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Molecular epidemiological investigation of PEDV and analysis of genetic variation of S gene in South China during 2011-2015

LI Zhi-li1，HUANG Shu-jian1，MA Jing-yun2，BI Ying-zuo2
（1.School of Life Science and Engineering，F(xiàn)oshan Umiversity，F(xiàn)oshan 528231，China；2.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The study conducted a large scale molecular epidemiological investigation and five years monitoring of nine swine herds with the outbreak of diarrhea located in geographically separate regions of south China by RT-PCR. Porcine intestinal and fecal samples were collected from 18 swine farms in five provinces （Guangdong province，Guangxi province，F(xiàn)ujian province，Sichuan province，Jiangsu province） in south China with the piglets younger than 7 days old that showed watery diarrhea and dehydration. 35 spike （S） genes were determined to analyze the genetic diversity and epidemiological features during 2011-2015. The results showed that all PEDV strains could be divided into two groups，Group1 and Group 2. Group1 had a close relationship with the United States strains and Taiwan strains，and had four subgroups，G1-1，G1-2，G1-3 and G1-4. Group 2 felled into the same branch with the previous Chinese isolates from 2004 that had two subgroups，G2-1 and G2-2. The subgroup G1-2 and G1-3 comprised most of the strains isolated in south China while the subgroup G2-2 comprised thestrain isolated in 2004 （JS-2004-2） and eight else isolated in south China in our study. It is remarkably that clinical morbidity caused by two types of PEDV strains were quite different，strains in G2-2 caused relatively minor mild clinical manifestations，presenting a smaller mortality and shorter onset period，while strains in G1-2 and G1-3 is caused an outbreak of acute infectious diseases，showing a larger mortality and longer period especially PEDV strains in G1-3.

porcine epidemic diarrhea virus；dynamic investigation；Spike gene；genetic variation

S855.3

A

1004-874X（2016）11-0127-09

2016-07-24

國家自然科學(xué)基金（31502071）

李智麗（1983-），女，博士，講師，E-mail: pinganzhili@163.com

畢英佐（1944-），男，研究員，E-mail: yzbi@scau.edu.cn

李智麗，黃淑堅(jiān)，馬靜云，等. 2011—2015年我國南方地區(qū)PEDV分子流行病學(xué)調(diào)查及S基因遺傳變異分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（11）：127-135.