潘孝成，趙瑞宏，沈?qū)W懷，張丹俊，胡曉苗，周學(xué)利，戴銀，侯宏艷，錢(qián)坤

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體的制備與應(yīng)用

潘孝成，趙瑞宏，沈?qū)W懷，張丹俊，胡曉苗，周學(xué)利，戴銀，侯宏艷，錢(qián)坤

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

用豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）SD株免疫產(chǎn)蛋雞，收集卵黃制備出特異性PEDV抗體。人工感染后治療結(jié)果顯示，一次抗體治療組可減少死亡率50.0個(gè)百分點(diǎn)，兩次抗體治療組可減少死亡率83.3個(gè)百分點(diǎn)；3家自然發(fā)病豬場(chǎng)的臨床應(yīng)用表明，相較于對(duì)照組，抗體治療組可減少仔豬死亡率分別為67.7個(gè)百分點(diǎn)、57.0個(gè)百分點(diǎn)和77.5個(gè)百分點(diǎn)。

豬流行性腹瀉病毒；卵黃抗體；制備；應(yīng)用

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈有囊膜的RNA病毒，是一種可導(dǎo)致豬以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的傳染病原。1971年，豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）首次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)[1]，我國(guó)內(nèi)地自20世紀(jì)80年代初以來(lái)陸續(xù)有關(guān)于PEDV分離和鑒定的報(bào)道[2]。2010年以來(lái)，我國(guó)豬流行性腹瀉的危害一直比較嚴(yán)重[3-5]。特異性的卵黃抗體是一種易得、價(jià)廉和高效的疫病防控手段，已在獸醫(yī)臨床得到了廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)利用PEDV SD株免疫產(chǎn)蛋母雞，制備出抗PEDV的特異性卵黃抗體，經(jīng)攻毒治療試驗(yàn)和臨床應(yīng)用，證實(shí)具有良好的治療效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2014年9月至2015年6月在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進(jìn)行。

1.2 主要材料

36周齡產(chǎn)蛋母雞來(lái)自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所試驗(yàn)雞場(chǎng)，1日齡未吃初乳仔豬購(gòu)自安徽省巢湖市某豬場(chǎng)，PEDV SD株由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室分離、鑒定、保存，超濾離心管購(gòu)自millipore公司，弗氏完全佐劑（CFA）和弗氏不完全佐劑（IFA）均購(gòu)自sigma公司，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的抗原快速檢測(cè)試劑盒（膠體金試劑）購(gòu)自BioNote公司。

1.3 蛋雞免疫

取PEDV SD株的第9代Vero細(xì)胞培養(yǎng)物（TCID50為10-6.25/0.1 mL）作為免疫原，共免疫產(chǎn)蛋雞30只，首次免疫，免疫原用CFA乳化，其余用IFA乳化，免疫原和佐劑的比例為1∶1，免疫方式為胸部肌肉多點(diǎn)注射，免疫劑量為1 mL/次，免疫次數(shù)為4次，每次免疫間隔為2周。二免后2周開(kāi)始收蛋測(cè)抗體效價(jià)。

1.4 抗體效價(jià)測(cè)定

PEDV SD株的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心5 min，取上清液，用30 kDa超濾離心管濃縮至100倍作為瓊擴(kuò)抗原，用生理鹽水將蛋黃按1∶4稀釋?zhuān)? 000 r/min勻漿2 min，4層紗布過(guò)濾后，用生理鹽水倍比稀釋加到瓊擴(kuò)的孔中，以出現(xiàn)沉淀線(xiàn)的最高稀釋度作為抗體效價(jià)。

1.5 抗體制備

取抗體效價(jià)高于1∶32的蛋黃，用生理鹽水將蛋黃按1∶4稀釋?zhuān)? 000 r/min勻漿2 min，4層紗布過(guò)濾后，按萬(wàn)分之一的比例加入硫柳汞，并加入青、鏈霉素各1 000單位/mL，分裝后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 人工感染和治療試驗(yàn)

未吃初乳的仔豬18頭，每頭豬口服5 mL PEDV SD株第8代Vero細(xì)胞培養(yǎng)物，26 h后均出現(xiàn)明顯的水樣腹瀉，將18頭發(fā)病仔豬分成3組，每組6頭，第1組攻毒后26 h和36 h各口服制備的PEDV蛋黃液3 mL，第2組攻毒后26 h口服制備的PEDV蛋黃液3 mL，第3組攻毒后26 h和36 h各口服生理鹽水3 mL，連續(xù)觀察3周。

1.7 臨床應(yīng)用試驗(yàn)

疑似發(fā)生PEDV的豬場(chǎng)，經(jīng)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的抗原快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，發(fā)病仔豬間隔10 h口服制備的PEDV蛋黃液3 mL兩次，發(fā)病未治療和/或僅使用抗生素治療的仔豬作為對(duì)照組，連續(xù)觀察3周。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體效價(jià)

二免后2周測(cè)得抗體效價(jià)為1∶8，三免后2周測(cè)得抗體效價(jià)為1∶32，四免后2周測(cè)得抗體效價(jià)為1∶128，四免后4周測(cè)得抗體效價(jià)為1∶514，四免后6周測(cè)得抗體效價(jià)為1∶256，四免后8周測(cè)得抗體效價(jià)為1∶64，四免后10周測(cè)得抗體效價(jià)為1∶4。

2.2 人工感染和治療試驗(yàn)

自安徽省巢湖市某豬場(chǎng)購(gòu)入剛出生未吃初乳的仔豬18頭，每頭豬口服5 mL PEDV SD株第9代Vero細(xì)胞培養(yǎng)物后18 h，開(kāi)始出現(xiàn)水樣腹瀉，26 h后均出現(xiàn)明顯的水樣腹瀉。生理鹽水治療組的6頭仔豬在攻毒后42～80 h全部死亡，兩次卵黃抗體治療組在攻毒后40 h仔豬死亡1頭，1次卵黃抗體治療組在攻毒后44 h、48 h、72 h仔豬各死亡1頭，見(jiàn)表1。

表1 仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 臨床應(yīng)用試驗(yàn)

合肥郊區(qū)、肥東、廣德的3家豬場(chǎng)，發(fā)病仔豬臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉，腸道出血，仔豬一般在10日齡內(nèi)死亡，經(jīng)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的抗原快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，應(yīng)用制備的PEDV蛋黃液進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，PEDV蛋黃液治療效果顯著，相較于對(duì)照組，可減少仔豬死亡率分別為67.7個(gè)百分點(diǎn)、57.0個(gè)百分點(diǎn)和77.5個(gè)百分點(diǎn)，具體見(jiàn)表2。

表2 臨床應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究取PEDV SD株的第9代Vero細(xì)胞培養(yǎng)物用佐劑乳化后免疫適齡產(chǎn)蛋雞，三免后2周抗體達(dá)到較高效價(jià)（瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶32），四免后4周測(cè)得抗體效價(jià)最高（瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶514），至四免后10周抗體效價(jià)降至較低水平（瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶4），維持較高抗體水平（瓊擴(kuò)效價(jià)≥1∶32）的時(shí)間約為2個(gè)月。取抗體效價(jià)高于1∶32的蛋黃所制備的卵黃液，用于人工感染后的治療及臨床應(yīng)用均獲得良好的效果。研究結(jié)果表明，PEDV SD株作為免疫原免疫產(chǎn)蛋雞，產(chǎn)生了特異性的高效免疫應(yīng)答，制備的卵黃抗體可用于PED的針對(duì)性防控。

1973年我國(guó)上海發(fā)生了仔豬急性腹瀉，1984年證實(shí)病原為PEDV[2]，隨后我國(guó)各地陸續(xù)有PED發(fā)生的報(bào)道。1995年起，我國(guó)開(kāi)始使用豬流行性腹瀉病毒+傳染性胃腸炎病毒（PEDV+TGEV）二聯(lián)滅活苗，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)在PED防控方面取得較好的效果。2010年底開(kāi)始，我國(guó)不少地區(qū)的很多豬場(chǎng)發(fā)生仔豬腹瀉，流行面較廣，呈暴發(fā)性流行，2011—2012年流行面積進(jìn)一步擴(kuò)大，疫情繼續(xù)蔓延，一些地區(qū)流行較為嚴(yán)重[3-5]，使用PEDV+TGEV二聯(lián)滅活苗以及PEDV弱毒疫苗的豬場(chǎng)，也暴發(fā)了嚴(yán)重的腹瀉病，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。2013年起，PED的發(fā)病出現(xiàn)減弱趨勢(shì)[6]，但其危害依然存在，豬場(chǎng)一旦暴發(fā)豬流行性腹瀉，采用對(duì)癥治療效果并不理想，用PEDV SD株作為免疫原制備的特異性卵黃抗體，為有效解決當(dāng)前PED對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)的危害提供了一種可行的手段。

[1]Pensert M B,De Bouck P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J].Arch Virol,1978,58(3):243-247.

[2]宣華，邢德坤，王殿瀛，等.應(yīng)用豬胎腸單層細(xì)胞培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒的研究[J].獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1984，4（3）：202-208.

[3]劉孝珍，陳建飛，時(shí)洪艷，等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（3）：180-183.

[4]蔡汝健，張樂(lè)宜，宋長(zhǎng)緒.2010—2013年華南地區(qū)豬流行性腹瀉病流行情況調(diào)查及防控效果[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（14）：104-105.

[5]郭容利，何孔旺，茅愛(ài)華，等.2011—2012年我國(guó)部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒ORF3基因的遺傳變異分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45（5）：1-4.

[6]楊漢春.2013年豬病流行情況與2014年流行趨勢(shì)及防控對(duì)策[J].豬業(yè)科學(xué)，2014（2）：42-43.

（編輯：郭玉翠）

Preparation and Application of Egg Yolk Antibody Against Porcine Epidemic Diarrhea Virus

PAN Xiaocheng,ZHAO Ruihong,SHEN Xuehuai,ZHANG Danjun,HU Xiaomiao, ZHOU Xueli,DAI Yin,HOU Hongyan,QIAN Kun
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Anhui Academy of Agricultural Science,Hefei 230031,China)

Antibody against porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)was obtained from egg yolk of chickens immunized with PEDV SD strain.After challenge exposures to PEDV,the piglets were treated orally with the egg yolk antibody against PEDV,the experiment showed that the mortality rate was 100 percent in the control group, whereas only 50.0 percent and 16.7 percent in the antibody treatment group for one and two times,respectively. In the naturally infected farms,the mortality rate of treatment group piglets were reduced 67.7 percent,57.0 percent and 77.5 percent,respectively.

porcine epidemic diarrhea virus(PEDV);egg yolk antibody;preparation;application

S858.28

A

1002-1957(2016)03-0119-02

2016-03-09

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（13C0405）；院長(zhǎng)青年創(chuàng)新基金（11B0417）；安徽省生豬產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展資金項(xiàng)目；安徽省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目

潘孝成（1971-），男，安徽霍邱人，助理研究員，博士，主要從事畜禽傳染病研究工作.E-mail：pxcpyq@sina.com

錢(qián)坤（1964-），男，安徽鳳陽(yáng)人，副研究員，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)科研管理工作.E-mail：qiankun581@126.com