張 明 綜述，高 飛，羅 果，朱紹玲 審校

(1.遵義醫(yī)學院物理學教研室，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心，貴州遵義 563003；3.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，貴州遵義563003)

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·綜 述·

人體血液拉曼光譜在癌癥檢測中的應用*

張 明1綜述，高 飛1，羅 果2△，朱紹玲3審校

(1.遵義醫(yī)學院物理學教研室，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心，貴州遵義 563003；3.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，貴州遵義563003)

光譜；腫瘤；生物大分子；蛋白質；表面增強拉曼散射

癌癥是危害人類健康的最主要“殺手”之一。目前，全球每年約有數(shù)以千萬計人被確診為癌癥，數(shù)百萬人被癌癥奪去生命。不管是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，癌癥發(fā)病率都呈現(xiàn)出高發(fā)態(tài)勢。由于我國人口基數(shù)大，醫(yī)療衛(wèi)生基礎相對不發(fā)的，造成了我國癌癥發(fā)病人數(shù)和病死率都高。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織在《全球癌癥報告2014》中稱：中國新增癌癥病例高居第一位，死亡病例世界第一[1-2]。由于癌癥在早期癥狀不是很明顯，當發(fā)現(xiàn)確診為癌癥時，往往已經是中晚期了，因此對癌癥進行早期的篩查，做到早診斷、早治療是可以顯著提高癌癥患者的生存率的，這就需要不斷研究和開發(fā)關于癌癥篩查和早期診斷的方法。

目前，癌癥的診斷方法主要有X射線攝影、超聲檢查、CT檢查、MRI檢查、內窺鏡檢查、組織細胞活檢以及相關腫瘤標志物的檢出等[3-4]。采用超聲影像診斷的方法通?？梢园l(fā)現(xiàn)具有一定大小的腫瘤包塊，內窺鏡檢查可以發(fā)現(xiàn)消化系統(tǒng)及婦科的一些腫瘤，再結合進一步的組織細胞活檢來確診是否是癌癥，而通常發(fā)現(xiàn)也已經錯過了最佳治療時期。臨床研究表明，腫瘤在其代謝過程中會出現(xiàn)一些相關產物可用于作為腫瘤標志物，例如血清癌胚抗原(CEA)，正常值小于等于3.45 μg/L，發(fā)現(xiàn)在胃癌、肺癌、尿道癌、宮頸癌、卵巢癌等多種癌癥患者中出現(xiàn)了CEA升高，其中結腸癌患者最為明顯；甲胎蛋白(AFP)是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物，也是經美國食品藥品管理局認證使用的肝癌血清診斷標志物，常用于原發(fā)性肝癌的篩選；前列腺特異抗原(PSA)，正常值小于4 μg/L，在前列腺癌中，30%～86%的患者都出現(xiàn)了PSA的升高。采用單個腫瘤標志物進行判別時，得到的陽性預測值和陰性預測值都不高，從而判別的正確率較低。另外，某些腫瘤標志物在某些生理情況下或其他疾病也可以異常升高，需注意鑒別。采用以上診斷方法也就存在一定的缺陷，如特異性及靈敏度低，操作復雜，有創(chuàng)傷，費用高等，所以研究一種快速、簡便、安全的早期癌癥檢測方法可以為癌癥篩查和診斷開辟一條新的途徑。

拉曼光譜技術是印度科學家拉曼(C.A.Raman)在研究單色光通過純苯溶液的散射時，發(fā)現(xiàn)了有極少的散射光子出現(xiàn)了頻移(拉曼散射)并在此基礎上逐漸發(fā)展起來的一種分子光譜技術。水的拉曼散射十分微弱，將實驗樣品溶于水后基本不受其干擾，從而拉曼光譜技術被廣泛應用于水溶性分子的研究中，獲得分子結構和信息。從生物醫(yī)學角度，構成細胞的蛋白質、核酸、脂類和糖類等大分子都是水溶性的，因此拉曼光譜適合于生物大分子的光譜研究，包括生物大分子的二級結構，如分子基團如氨基、羧基、芳環(huán)和二硫鍵等，其中值得注意的是，對于維持蛋白質等生物大分子高級結構和化學功能具有重要意義的二硫鍵，在紅外吸收光譜中顯示很弱，而在拉曼散射光譜中卻有較強的信號。但是生物大分子的拉曼光譜也存在一個問題，散射截面很小，造成拉曼散射的強度就比較微弱，如果要獲得較強的拉曼光譜強度就需要通過提高激發(fā)光源的功率或者延長取譜時間，而用大功率的激光光源照射樣品，往往會對樣品造成一定的損傷且易受到樣品本身自體熒光的干擾，從而影響到對光譜的檢測和分析，一定程度上限制了該項技術在生物醫(yī)學中的應用和發(fā)展[5]。直到1974年，F(xiàn)leischmann等[6]觀測到在粗糙的銀電極表面吡啶分子上，獲得了高強度的拉曼散射信號，經過檢測，發(fā)現(xiàn)拉曼散射強度增大了106倍。而現(xiàn)在通過利用納米銀制備基底上觀測標本的拉曼散射強度可獲得較常規(guī)拉曼光譜大幾萬甚至幾十萬倍的增益[7]，這就使得這種表面增強拉曼散射光譜技術可以成為研究生物大分子的重要手段[8]。

人體是由大量水分構成，水分占到了體質量的50%～80%，主要以體液形式存在，包括血液、尿液、唾液和淋巴液等以及存在于細胞質中。體液檢測又以血液檢測應用得最多，如對血液中低密度膽固醇含量的檢測可以判斷心血管方面的健康狀況，對血液中葡萄糖水平的檢測可以用于監(jiān)測糖尿病患者的狀況等。血液是由血漿和血細胞組成，血細胞包括白細胞、紅細胞和血小板，血漿中的水占到了90%～92%，其余為血漿蛋白，血漿蛋白以白蛋白、球蛋白和纖維蛋白為主，并且這3類蛋白都為親水膠體。除此以外，血漿中還含有游離態(tài)DNA、無機鹽、脂肪、糖類和激素等化學成分，這些成分的變化都可以反映機體的健康狀況。但在利用血漿進行檢測時，往往需要加入抗凝劑，造成一些干擾。血細胞中以紅細胞為主，紅細胞中富含血紅蛋白，占到了細胞質量的32%，脂類、糖類和各種電介質占4%，其余為水。血紅蛋白有珠蛋白和亞鐵蛋白組成，血紅蛋白在氧濃度高的地方與氧結合形成氧合血紅蛋白，在氧濃度低的地方與氧脫離，變?yōu)檫€原血紅蛋白。另外，在對血液檢測中，經常會提取血清進行分析，血清是新鮮血液在不加入任何抗凝劑的情況下，自然凝固后分離出的淡黃色透明液體，也可通過血漿去除纖維蛋白原而獲得。運用血清檢測最大的好處就是可以避免抗凝劑的干擾。血清中包含蛋白質、脂肪、糖類、無機鹽和維生素等營養(yǎng)成分以及抗體(免疫球蛋白)。因此通過對血液樣品的成分檢測可以獲得大量關于生物大分子及其基團的振動光譜信息，這些信息可以反映人體在癌變過程中生物分子在構象和數(shù)量上發(fā)生的某種變化，從而在生物醫(yī)學上有著重要的意義。

1 以血液為樣本的相關研究

1.1 血清樣本研究 葉慧帆等[9]對20例卵巢癌患者的血清樣本通過激光共聚焦顯微拉曼光譜儀進行光譜研究，并與健康志愿者進行對比分析。兩組血清樣本的光譜分別取平均值后，在同一圖層中可以進行比較。發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組的光譜形態(tài)和譜峰基本相似，但在有些譜峰位置，卵巢癌患者的拉曼光譜強度明顯要低于健康人，這些譜峰位于1 010、1 158、1 283、1 520、1 646、2 307和2 661 cm-1拉曼位移處[9]；而在除此之外的其他譜峰實驗組血清的拉曼光譜強度又均高于健康人的。潘建基等[10]在對血清拉曼光譜研究中發(fā)現(xiàn)在900～1 000 cm-1和1 600～1 700 cm-1的兩個區(qū)間，實驗組鼻咽癌患者血清的拉曼光譜強度要低于對照組的；但在1 200～1 400 cm-1處，對照組血清的拉曼光譜強度又要低于實驗組鼻咽癌患者[10]。利用SPSS軟件對實驗組鼻咽癌患者與對照組進行主成分分析，經過處理后，在兩組光譜中獲得7個主成分得分，選取具有顯著差異的主成分進行判別分析，可得出兩組血清樣品的靈敏度為89.7%，特異性為91.7%，總判別正確率為90.7%。劉仁明等[11]對肝癌患者血清的研究表明，實驗組肝癌患者血清的拉曼光譜在有些譜峰位置相對于對照組變得很微弱,甚至消失，這些位置位于630 、720 、812 和1 578 cm-1處[11]，另外在實驗組中有幾個譜峰相對于對照組發(fā)生了一定的頻移，比較明顯的在1 130 cm-1和1 204 cm-1處的譜峰，肝癌患者就分別藍移到1 135 cm-1和1 269 cm-1處，除此之外，實驗組在558 cm-1附近出現(xiàn)了一個新的譜峰，可作為肝癌患者的特征峰來考慮。

1.2 血漿樣本研究 馮尚源等[12]通過對采集來的32例胃癌患者的新鮮血液加入抗凝劑后，離心去除血細胞后獲得血漿樣本進行拉曼光譜研究。通過實驗組與對照組的拉曼光譜的比較，發(fā)現(xiàn)實驗組胃癌患者血漿的拉曼光譜存在著3個譜峰強度明顯高于對照組，這些譜峰分別位于1 330、1 445、1 580 cm-1。通過對譜峰歸屬的進一步研究，1 330 cm-1的譜峰歸屬于血漿中游離態(tài)的核酸，說明胃癌患者血漿中的核酸相對于健康人要高，從而可以用來檢測癌癥的發(fā)生與發(fā)展。而1 445 cm-1譜峰則歸屬于膠原或磷脂C-H 鍵的彎曲振動，在相關研究文獻中，該譜峰曾作為胃癌患者的特征峰來考慮[12]。1 580 cm-1的譜峰則歸屬于苯基丙氨酸C=C 的彎曲振動，表面實驗組胃癌患者血漿中的苯基丙氨酸相對于健康人要高。但在其他5個譜峰位置，胃癌患者血漿的拉曼光譜強度明顯要低于健康人對照組，這些譜峰位于589、638、813、1 134 cm-1處[12]。這些譜峰主要歸屬于糖類和氨基酸，說明胃癌患者在癌變過程中造成體內糖類和氨基酸的消耗比較大，造成血漿中的含量減少。再利用SPSS軟件對實驗組與對照組進行統(tǒng)計分析，可獲得診斷特異性與靈敏度可以分別為到91%與79.5%，總判別正確率為85.2%。

1.3 血細胞樣本研究 喬世寶等[13]對7例白血病患者血液中的紅細胞的拉曼光譜進行研究，通過實驗組白血病患者紅細胞與健康人的拉曼光譜的對照發(fā)現(xiàn)，兩組光譜具有八個明顯的譜峰，其中位于1 385 cm-1的譜峰，實驗組相對于對照組強度明顯減弱甚至消失，而1 425 cm-1的譜峰卻變寬，變強。周雪等[14]應用血紅蛋白的拉曼光譜進行食管癌診斷的研究發(fā)現(xiàn)，實驗組食管癌患者的光譜強度相對于健康人要弱，特別是在位于1 562 cm-1譜峰處；另外，對照組血紅蛋白拉曼光譜在1 639 cm-1處的光譜強度明顯比1 591 cm-1處要大，而對于實驗組食管癌患者來說，這兩處譜峰的強度非常接近。

熊洋等[15]通過與遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院及其附屬醫(yī)院合作，利用宮頸癌患者的氧合血紅蛋白開展基于表面增強拉曼散射的光譜研究。圖1為兩組氧合血紅蛋白平均拉曼光譜A及經過平滑處理后B的對比圖，可以看出光譜主要存在9個譜峰，但實驗組宮頸癌患者的譜峰強度明顯要比健康人要弱，并且在662、720和815 cm-1的位置，實驗組的譜峰基本消失；除此之外，實驗組的一些譜峰相對于對照組來說也發(fā)生了較明顯的頻移。采用SPSS軟件的PCA分析結合獨立變量T檢驗統(tǒng)計分析方法得到最具差異的3個PCA得分PC1、PC1和PC3[15]，利用此3個PCA得分做出的SERS光譜PCA得分三維散點圖可以很好的區(qū)分健康女性和宮頸癌患者，診斷的特異性與靈敏度[16]都分別為81.8%和86.4%，總判別正確率為84.1%。

圖1 對照組(a)和實驗組(b)的氧合血紅蛋白平均 SERS光譜對比圖

2 展 望

通過對人體血液樣本中血清、血漿和紅細胞拉曼光譜的研究等方面做了綜述，表明拉曼光譜技術在臨床上檢測早期癌癥具有一定的發(fā)展前景。由于血液樣品包含有大量有關人體健康狀況的生物大分子信息且易于采集，決定了通過利用血液的拉曼光譜分析可以篩查癌癥的可行性。但該項技術整體還處于分散實驗研究階段，沒有形成統(tǒng)一的技術、篩查和診斷標準。隨著拉曼光譜技術的不斷成熟和完善，該項技術將會有重大突破。目前對生物大分子的拉曼光譜研究一般都需要采用表面增強技術，也就是自制表面增強基底，基底的自制主要采用一些納米級的金屬微粒子，如金、銀等吸附在載玻片上，然后再對樣品進行檢測。但對最適合于水溶生物大分子的表面增強基質沒有統(tǒng)一的技術標準。最重要的是由于該研究處于分散研究狀況，采用的樣品獨立，癌癥類型獨立，研究方法也有差異，采集的實驗組數(shù)據(jù)獨立且很分散，光譜研究人員不能和臨床醫(yī)院開展大數(shù)據(jù)的采集研究，形成具有真正價值的數(shù)據(jù)庫及診斷標準。從臨床診斷上，拉曼光譜技術篩查與其他臨床診斷技術相結合，全面完整地解析癌癥信息，充分發(fā)揮其簡便、快捷、無損的特點，可以作為癌癥早期篩查的重要手段。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.038

國家自然科學基金資助項目(81460204)；遵義醫(yī)學院碩士啟動基金(F-638)。 作者簡介：張明(1980-)，副教授，碩士，主要從事生物醫(yī)學光譜學方面的研究?！?/p>

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