張傳濤,黃 群,劉業(yè)方，郭尹玲，辜海英，王芳瑜，胡 蓉，扈曉宇△，鄭政隆

(1.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院感染科，成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學，成都 610075；3.成都市傳染病醫(yī)院肝病科,成都 610066)

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·生物信息學·

基于microRNAs調(diào)控的輕度慢性乙型肝炎炎癥活動的分子機制研究*

張傳濤1，2,黃 群2,劉業(yè)方2，郭尹玲2，辜海英1，王芳瑜2，胡 蓉3，扈曉宇1△，鄭政隆2

(1.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院感染科，成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學，成都 610075；3.成都市傳染病醫(yī)院肝病科,成都 610066)

目的 研究從microRNAs角度揭示輕度慢性乙型肝炎炎癥活動的分子機制。方法 將符合標準的病例分為輕度慢性乙型肝炎組與慢性HBV攜帶者組，借助Agilent Human microRNA 8×60 k微陣列芯片檢測血漿中microRNAs表達譜，求得兩組間的差異表達microRNAs譜(P<0.05)，借助microRNAs生物信息學分析軟件預測其靶基因并對靶基因進行GO功能富集分析和pathway分析。結(jié)果 兩組間的差異表達microRNAs共65條(P<0.05)，38條上調(diào)，27條下調(diào)；GO分析及pathway分析得到其功能主要涉及細胞增殖、生物黏附、生物合成過程的正/負調(diào)控、大分子生物合成過程中的正/負調(diào)控、蛋白氨基酸的磷酸化、RNA的生物合成過程、Wnt信號通路、MAPK 信號通路、Notch信號傳導途徑、Hedgehog信號通路、T細胞受體信號通路、TGF-β信號通路、mTOR信號通路、趨化因子信號通路JAK-STAT信號通路、鈣離子信號通路等。結(jié)論 輕度慢性乙型肝炎炎癥活動受特異性microRNAs調(diào)控，其涉及多個生命過程及通路。

輕度慢性乙型肝炎；炎癥活動；microRNAs調(diào)控

全球約20億人曾感染乙型肝炎病毒(HBV)，其中2.4億人為慢性HBV感染者[1]，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌[2]。2006年全國乙型肝炎血清流行病學調(diào)查表明，我國1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%[3-4]。2014年全國1～29歲人群乙型肝炎血清流行病學調(diào)查結(jié)果顯示:1～4歲、5～14歲和15～29歲人群HBsAg流行率分別為0.32%、0.94%和4.38%。雖然我國HBV感染率明顯下降，但是我國仍是肝病高發(fā)地區(qū)，仍嚴重影響我國人民健康的疾病，為社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類具有單鏈小分子RNAs，調(diào)控人體近1/3基因的功能[5]，miRNAs參與HBV感染后病毒與宿主之間的相互作用，能夠調(diào)控HBV復制、細胞外基質(zhì)生成及抑癌基因的沉默等過程[6-8]。深入研究miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡有望為進一步豐富HBV感染的發(fā)病機制。本研究借助Agilent Human miRNA 8×60 k微陣列芯片技術(shù)，從miRNAs調(diào)控角度揭示慢性乙型肝炎(簡稱“慢乙肝”)炎癥活動的機制，為今后控制慢乙肝肝臟炎癥活動、抗HBV藥物研發(fā)等提供研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例均來自成都市傳染病醫(yī)院等中心2012年8月至2013年4月門診，分為：攜帶者8例，輕度慢性乙型肝炎8例。納入標準： (1)符合輕度慢乙肝與慢性HBV攜帶者診斷；(2)就診前3個月內(nèi)未進行過中西醫(yī)抗病毒及保肝等治療；(3)患者的HBV-DNA為陽性；(4)年齡20～40歲；(5)同意并簽署知情同意書者；只有以上入選標準都滿足者，才能納入本臨床研究。輕度慢乙肝與攜帶者診斷標準：參照中華醫(yī)學會肝病學分會和中華醫(yī)學會感染病分會聯(lián)合制定《病毒性肝炎防治方案》(2000年修訂版)擬定輕度慢乙肝診斷標準[9]。參照中華醫(yī)學會肝病學分會和中華醫(yī)學會感染病分會聯(lián)合制定《慢性乙型肝炎防治指南》(2005年版)擬定慢性HBV攜帶者診斷標準[10]。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑 微陣列掃描儀(安捷倫，批號：P/N G2565BA)、不銹鋼雜交室(安捷倫，批號：P/N G2534A)、雜交室墊片幻燈片8微陣列(安捷倫，批號：P/N G2534A)、miRNA的完整標簽和HYB套件(安捷倫，批號：P/N 5190-0456)基因表達的洗滌液套裝(安捷倫，批號：P/N 5188-5327)、2100生物分析儀(安捷倫，批號：P/N g2938A)、RNA 6000納米試劑盒(安捷倫，批號：P/N 5067-1511)。

1.2.2 實驗方法 用血常規(guī)管 (EDTA抗凝)采取符合標準患者肘靜脈血10 mL，4 ℃靜置30 min，3 000 r/min離心20 min，提取血漿，RNA抽提，質(zhì)控合格，標記、雜交，Agilent Human miRNA 8×60 k微陣列芯片技術(shù)檢測，芯片洗滌、掃描，在線SAS系統(tǒng)中的“DiffGene”項目行T檢驗和SAM篩選，對篩選出來2倍以上表達差異的miRNAs利用miRNA生物信息學分析軟件進行靶基因預測，將篩選出來的靶基因行GO功能富集基因的分類和pathway分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 差異miRNAs篩選采用在線SAS系統(tǒng)分析(http://www.ebioservice.com)。比較采用配對t檢驗，miRNAs表達組間比較進行方差分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達miRNAs譜 將歸一化文件導入SAS系統(tǒng)中，輕度慢乙肝與慢性HBV攜帶者兩組間的差異表達miRNAs共65條(P<0.05)，38條上調(diào)，27條下調(diào)；2倍以上差異表達的miRNAs 30條，19條上調(diào)，11條下調(diào)。上調(diào)的19條為:hsa-miR-1246、hsa-miR-3679-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-1268、hsa-miR-126、hsa-miR-4298、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-4270、hsa-miR-320c、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-223、hsa-miR-1202、hsa-miR-3162、hsa-miR-27a、hsa-miR-1915、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-3195、hsa-miR-4281等。下調(diào)的11條為：hsa-miR-26a、hsa-miR-29a、hsa-miR-1238、hsa-miR-720、hsa-miR-122、hsa-miR-1228、hsa-miR-1280、hsa-miR-1281、hsa-miR-1234、hsa-miR-191*、hsa-miR-20a等。

2.2 差異miRNAs靶基因GO功能分析 利用miRNA生物信息學分析軟件miRDB,microRNA,TarBase等對兩組間2倍以上的差異miRNAs進行靶基因預測，利用DAVID在線軟件對所預測的靶基因進行GO功能富集分析。

上調(diào)的差異miRNAs所對應的靶基因共參與61項顯著生物功能(表1)，主要包括細胞增殖、生物黏附、細胞黏附、細胞內(nèi)的信號級聯(lián)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、蛋白定位、大分子生物合成過程中的積極調(diào)控、大分子代謝過程正調(diào)控、氮化合物的代謝過程的正調(diào)控、生物合成過程中的正/負調(diào)控、細胞凋亡、蛋白氨基酸的磷酸化、細胞周期、細胞遷移等下調(diào)的差異miRNAs所對應的靶基因共參與76項顯著生物功能(表2)，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達的正/負調(diào)控、轉(zhuǎn)錄正/負調(diào)控、大分子代謝過程正/負調(diào)控、RNA代謝過程正調(diào)控、氮化合物的代謝過程的正調(diào)控、細胞生物合成過程中的積極調(diào)控、酶聯(lián)受體蛋白信號通路、細胞增殖、細胞遷移、蛋白質(zhì)定位、細胞運動、Wnt受體信號通路、鉀離子轉(zhuǎn)運、RNA的生物合成過程及核堿基、核苷、核苷酸和核酸的代謝過程的正調(diào)控等。

2.3 差異 miRNAs靶基因調(diào)控的Pathway分析 輕度慢乙肝組/慢性HBV攜帶者組上調(diào)差異miRNAs的靶基因參與的顯著性信號通路28條(圖1)，包括黏著、軸突導向、胞吞作用、心臟相關(guān)疾病(肥厚性心肌病、擴張型心肌病、致心律失常性右室心肌病等)、肌動蛋白骨架的調(diào)節(jié)、白細胞跨內(nèi)皮遷移、Janus激酶(JAK)-信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號傳導途徑、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、Wnt信號通路、Notch信號傳導途徑、胰島素信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、p53信號通路等。

表1 輕度慢乙肝組/慢性HBV攜帶者組上調(diào)差異miRNAs的靶基因GO分析

表2 輕度慢乙肝組/慢性HBV攜帶者組下調(diào)差異miRNAs的靶基因GO分析

輕度慢乙肝組/慢性HBV攜帶者組下調(diào)差異miRNAs的靶基因參與的顯著性信號通路51條(圖2)，包括白細胞跨內(nèi)皮遷移、Hedgehog信號通路、II型糖尿病、腦膠質(zhì)瘤、促性腺激素釋放激素信號傳導途徑、黑色素生成、腎細胞癌、T細胞受體信號傳導途徑、卵母細胞減數(shù)分裂、鈣信號傳導途徑、肌動蛋白骨架的調(diào)節(jié)、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號傳導途徑、擴張型心肌病、胰島素信號傳導途徑、慢性髓細胞樣白血病、Notch信號傳導途徑、泛素介導性蛋白酶解、縫隙連接、ErbB信號傳導途徑、粘著斑、粘著連接、長時程增強、癌癥途徑、緊密連接、胞吞作用、MAPK信號傳導途徑、Wnt信號通路、軸突導向、Notch信號通路、mTOR信號通路、p53信號通路、O-聚糖的生物合成、脂肪細胞因子信號通路、趨化因子信號通路、TGF-β信號通路、癌癥途徑(大腸癌、腎細胞癌、小細胞肺癌等)等。

圖1 輕度慢乙肝組/慢性HBV攜帶者組上調(diào)差異 miRNAs的靶基因通路

圖2 輕度慢乙肝組/慢性HBV攜帶者組下調(diào)差異 miRNAs的靶基因通路

3 討 論

本研究借助Agilent Human miRNA 8×60 k微陣列芯片技術(shù)篩選慢乙肝組與慢性HBV攜帶者組之間差異miRNAs譜，其中顯著性(2倍以上)差異表達30條，19條上調(diào)，11條下調(diào)。進一步借助miRNA生物信息學分析軟件DAVID對差異miRNAs預測靶基因功能進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，其功能主要涉及生物黏附、氮化合物的代謝過程的正/負調(diào)控、生物合成過程的正/負調(diào)控、大分子生物合成過程中的積極調(diào)控、細胞生物合成過程中的正/負調(diào)控、蛋白氨基酸的磷酸化、基因表達的正/負調(diào)控、Wnt受體信號通路、鈣離子轉(zhuǎn)運等生命過程。KEGG分析結(jié)果提示其主要涉及Notch信號通路、鈣信號通路、Hedgehog信號通路、mTOR信號通路、p53信號通路、O-聚糖的生物合成、軸突導向、脂肪細胞因子信號通路、趨化因子信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路、胰島素信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、T細胞受體信號傳導途徑、TGF-β信號通路等。

本研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以影響JAK-STAT信號傳導途徑，HBV及其抗原成分能夠選擇性地抑制干擾素α(interferon-α)JAK-STAT信號傳導途徑分子和抗病毒蛋白的表達。IFN-αJAK-STAT信號傳導途徑分子STAT1的下調(diào)表達可能是HBV抑制IFNα抗病毒活性的機制之一[11]。作者推測特異性microRNA可能調(diào)控了JAK-STAT信號傳導途徑增強了IFN-α作用，增強機體免疫，進步引起肝臟炎癥活動。本研究發(fā)現(xiàn)miR-320c可能參與Wnt信號通路、TGF-β信號通路、細胞周期、MAPK信號通路等，TGF-β1誘導的肝星狀細胞細胞及HepG2細胞中Smad3C及Smad3L磷酸化、進而促進Smad2/3/4復合物形成，及其轉(zhuǎn)位入核和靶基因1型纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)mRNA表達可能是肝纖維化-肝癌發(fā)病的重要機制，肝纖維化中MAPK信號通路能夠?qū)Ω涡菭罴毎钚援a(chǎn)生影響[12]。MAPK抑制因子均能明顯抑制HSC細胞內(nèi)TGF-β1誘導的靶基因PAI-l mRNA的表達,MAPK通路參與HSC細胞內(nèi)TGF-β1信號通路靶基因PAI-1轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控而影響肝纖維化。作者推測特異性miRNA通過影響MAPK通路調(diào)控下經(jīng)TGF-β1/Smad 信號途徑而影響慢乙肝向肝纖維化發(fā)展，這為今后開展防治乙肝后肝纖維化提供思路[13]。Th17作為一種新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細胞(Helper T cells,Th)，參與乙型肝炎疾病的病程發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[14-15]。PI3K/AKt/mTOR信號通路參與Th17的增殖、分化[16],此信號通路的過度激活可導致正常細胞的自噬和凋亡紊亂，PI3K/AKt/mTOR信號通路可能激活Th17，促使CHB向肝硬化、肝細胞癌發(fā)展，推測特異性miRNA調(diào)控mTOR信號通路參與了慢乙肝炎癥活動進展為肝硬化、肝癌進程。阻斷Notch信號通路可減少慢性乙型肝炎患者外周單個核細胞Foxp3 mRNA的表達，Notch信號通路可能是持續(xù)感染的一個因素[17]，推測miRNA調(diào)控Notch信號通路可能是HBV持續(xù)感染的作用機制之一。另外，本研究發(fā)現(xiàn)差異microRNA還影響了細胞增殖、生物黏附、細胞粘附、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、建立蛋白定位、大分子生物合成過程中的積極調(diào)控、氮化合物的代謝過程的正調(diào)控、生物合成過程中的正/負調(diào)控、細胞凋亡、蛋白氨基酸的磷酸化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達的正/負調(diào)控、RNA的生物合成等多個生命過程，這些影響在慢乙肝炎癥活動中的作用仍需進一步驗證。

總之，本研究得到慢乙肝炎癥活動的差異miRNAs譜，初步揭示慢乙肝炎癥活動(打破免疫耐受狀態(tài))機制，這些差異miRNAs可能作為慢乙肝炎癥活動或其他肝臟相關(guān)疾病的潛在生物學標志物，但仍需進一步驗證研究。

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Study on molecular mechanism of mild chronic hepatitis inflammatory activity based on microRNAs regulation*

ZhangChuantao1,2,HuangQun2,LiuYefang2,GuoYinling2,GuHaiying1,WangFangyu2,HuRong3,HuXiaoyu1△,ZhengZhenglong2

(1.DepartmentofInfection,AffiliatedHospitalofChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610072,China;2.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;3.DepartmentofLiverDiseases,ChengduInfectiousDiseaseHospital,Chengdu,Sichuan610066,China)

Objective To reveal the molecular mechanism of inflammatory activity of mild chronic hepatitis B from the perspective of microRNAs regulation.Methods The cases conforming to the standard were divided into the mild chronic hepatitis B group and chronic HBV carriers group.The Agilent Human miRNA 8×60 k microarray chip was used to detect the expression profiles of microRNAs in plasma in order to achieve different expression spectrum of microRNAs between the two groups (P<0.05).Then the miRNA bioinformatics analysis software was used to predict the target gene,and did target genes GO functional enrichment analysis and pathway analysis.Results A total of 65 microRNAs bands were differentially expressed between the two groups (P<0.05),38 bands were up-regulated,27 bands were down-regulated.The GO analysis and Pathway analysis showed that the function mainly involved in cell proliferation,bioadhesion,positive/negative regulation of biosynthesis,positive/negative regulation of macromolecular biosynthesis,phosphorylated of protein amino acids,biosynthesis of RNA,Wnt signaling pathway,MAPK signaling pathway,Notch signaling transduction pathway,Hedgehog signaling pathway,T cell receptor signaling pathway,TGF-β signaling pathway,mTOR signaling pathway,chemokine signaling pathway,JAK-STAT signaling pathway,calcium ion signaling pathway,etc.Conclusion The inflammatory activity of mild chronic hepatitis B is regulated by specific microRNAs,involving multiple life processes and pathways.

mild chronic hepatitis B;inflammatory activity；microRNAs regulation

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.021

國家自然科學基金資助項目(81202624)。 作者簡介：張傳濤(1981-)，副主任醫(yī)師，博士，從事肝病及感染病研究?！?/p>

R512.6+2

A

1671-8348(2016)32-4527-04

2016-05-03

2016-07-29)