何文杰,江 波△，金從國，涂長玲，朱 穎，陳曉群

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院：1.干部醫(yī)療科；2.腫瘤研究所，昆明 650118)

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論著·臨床研究

老年晚期非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞與EGFR-TKI療效的相關(guān)性研究*

何文杰1,江 波1△，金從國2，涂長玲1，朱 穎1，陳曉群2

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院：1.干部醫(yī)療科；2.腫瘤研究所，昆明 650118)

目的 探討老年晚期非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的表達(dá)與表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)療效相關(guān)性。方法 66例老年晚期非小細(xì)胞肺癌的患者,以全部患者CTC表達(dá)數(shù)值的中位數(shù)為分界點(diǎn)，高于中位數(shù)的為高表達(dá)組，低于中位數(shù)的為低表達(dá)組均予EGFR-TKI類藥物治療，對其療效及預(yù)后進(jìn)行對比。生存分析采用Kaplan-Meier法,Logrank法檢驗(yàn)及Cox多因素回歸分析。結(jié)果 療效方面CTC低表達(dá)組有效率為53.3%(16/30)；CTC高表達(dá)組有效率為27.8%(10/36)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。預(yù)后方面CTC低表達(dá)組和CTC高表達(dá)組，中位總生存時(shí)間分別為22.8個(gè)月(95%CI:18.9～26.8個(gè)月)和18.3月(95%CI:14.8～21.9個(gè)月)，中位無進(jìn)展生存時(shí)間分別為11.5個(gè)月(95%CI:15.0～8.1個(gè)月)和5.6個(gè)月(95%CI:2.9～8.2個(gè)月)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CTC表達(dá)水平的變化與EGFR-TKI治療的療效及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，可作為老年晚期非小細(xì)胞肺癌患者EGFR-TKI治療的療效及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

癌，非小細(xì)胞肺;循環(huán)腫瘤細(xì)胞;表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)已成為導(dǎo)致人口死亡的重要疾病之一。局部腫瘤的進(jìn)展及血行轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。而腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提是腫瘤細(xì)胞能夠進(jìn)入外周血中形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)[1]。老年NSCLC患者初診時(shí)多已屬晚期，且其心肺功能差，并發(fā)疾病多，往往失去了手術(shù)及化放療的機(jī)會(huì)。表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)已成為具有EGFR突變的晚期NSCLC患者一線治療。但耐藥性的發(fā)生限制了EGFR-TKI的使用。如何在治療過程中適時(shí)評估EGFR-TKI療效及預(yù)后是一個(gè)難題。多項(xiàng)臨床研究均顯示CTC表達(dá)水平的變化與肺癌患者的療效及預(yù)后密切相關(guān)[2-4]。因此本文以老年晚期NSCLC患者為研究對象，旨在探討外周血CTC與EGFR-TKI療效及預(yù)后之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 篩選本院干部醫(yī)療科2012年10月至2014年5月收治且經(jīng)病理組織學(xué)診斷的老年晚期NSCLC患者66例，納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡超過70歲;(2)經(jīng)病理或脫落細(xì)胞學(xué)診斷確診為NSCLC；(3)經(jīng)影像檢查為Ⅲb～Ⅳ期患者；(4)預(yù)計(jì)生存時(shí)間大于3個(gè)月；(5)既往未行化療或放射治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)缺乏肺癌病理學(xué)診斷；(2)已接受化療及放射治療；(3)依從性較差。其中男40例，女26例，男女比例為1.82∶1.00，年齡70～84歲，平均年齡76歲，病理類型：腺癌58例，鱗癌8例。TNM分期：ⅢB期4例，Ⅳ期62例，功能狀態(tài)(PS)評分0～1分44例，≥2分22例。治療前后均行胸腹部CT、彩超、顱腦MRI、心電圖，血常規(guī)、血生化及腫瘤標(biāo)志物檢查。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，以全部患者CTC表達(dá)數(shù)值的中位數(shù)68.5為分界點(diǎn)，高于中位數(shù)的為CTC高表達(dá)組，低于中位數(shù)的為CTC低表達(dá)組。本研究已獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 根據(jù)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)從以下3種EGFR-TKI類藥物中任選一種。吉非替尼片(阿斯利康公司生產(chǎn))使用劑量為每次250 mg,口服，每天1次；厄洛替尼片(美國羅氏公司生產(chǎn))使用劑量為每次150 mg,口服，每天1次；鹽酸?？商婺崞?浙江貝達(dá)藥業(yè)公司生產(chǎn))使用劑量為每次125 mg,口服，每天3次。無論選擇何種藥物均至少服用1個(gè)月。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 標(biāo)本采集 所有患者在治療前先從肘正中靜脈中抽血1 mL,加入肝素抗凝混勻，并在采集后2 h內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.2.2.2 抗體及試劑 CD45-PC5、CK18-FITC、EGFR-PE、NH4CL溶血素，均購于美國Beckman coulter公司。流式細(xì)胞儀EPICS XL(美國Beckman coulter公司)。小鼠抗人cytokeratin 18(CK18/PE)&小鼠(Isotype Control/PE)kit；小鼠抗人CD45(Leuko-cyte Common Antigen)/PE-Cy5和小鼠Isotype Control；小鼠抗人EGFR/FIT&小鼠 Isotype Control/FITC；FACSTM Permeabilizing Solution2(Perm2)破膜通透液(10×)；淋巴細(xì)胞分離液。均購于美國Beckman coulter公司。

1.2.2.3 CTC的檢測 取試管加入20 μL CD45-PC5、20 μL EGFR-PE和20 μL CK18-FITC,加入肝素抗凝的全血100 μL，搖勻后避光室溫保存30 min。然后加入NH4CL溶血素2 mL溶血，15 min后上機(jī)檢測，表達(dá)CD45-CK18+的細(xì)胞為患者外周血?dú)埩舻哪[瘤細(xì)胞(CTC)。取患者肝素抗凝血5 mL混勻。用磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水將血液1∶1稀釋。用15 mL離心管先加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液5 mL，再加入稀釋后的血液10 mL，延管壁緩緩加入到Ficoll上層。2 300 r/min離心30 min,收集單核細(xì)胞層界面細(xì)胞，加入2 mL PBS，輕輕混勻，1 000 r/min離心5 min,棄上清液。分別取100 μL于兩只流式反應(yīng)管中，實(shí)驗(yàn)管加入20 μL CD45/PE-Cy5和20 μL CK18/PE，對照管加入同型對照IgG-PC5、IgG-PE，室溫避光靜置反應(yīng)30 min，加入2 mL PBS，輕輕混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。兩管中分別加入1%多聚甲醛500 μL，室溫避光反應(yīng)10 min,PBS漂洗離心去上清液。兩管中分別加入破膜通透液500 μL，室溫避光反應(yīng)10 min，PBS漂洗離心去上清液。

1.2.3 療效評價(jià) 療效按WHO實(shí)體瘤評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)，疾病進(jìn)展(PD),CR+PR為有效，CR+PR+SD為控制。無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)指自治療首日至病變進(jìn)展日；總生存期(overall survival,OS)為自治療首日至死亡日或失訪日，均以月計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，非正態(tài)性分布數(shù)據(jù)用M(P25，P75)表示，采用配對秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析；生存分析采用Kaplan-Meier法,Log rank法檢驗(yàn)及Cox多因素回歸分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CTC與臨床因素的關(guān)系 在66例患者中，CTC表達(dá)在不同性別、年齡、病理類型、分化程度、臨床分期、PS評分間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 晚期非小細(xì)胞肺癌CTC表達(dá)水平與臨床因素的關(guān)系

2.2 CTC與EGFR-TKI療效的關(guān)系 本組66例患者中,總有效率為39.4%(26/66)，疾病控制率為60.6%(40/66)。CTC低表達(dá)組有效率為53.3%(16/30),疾病控制率為80.0%(24/30)；CTC高表達(dá)組有效率為27.8%(10/36)，疾病控制率為44.4%(16/36)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 CTC表達(dá)水平與EGFR-TKI療效的關(guān)系

2.3 EGFR-TKI治療前后CTC表達(dá)水平的變化 本組66例患者中，治療有效的40例患者CTC表達(dá)水平治療前后變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療無效的26例患者CTC表達(dá)水平治療前后變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4 CTC表達(dá)水平與生存期的關(guān)系 本組病例中位OS為20.6個(gè)月(95%CI:17.9～23.4個(gè)月)，1年生存率為61.8%，3年生存率為13.5%。CTC低表達(dá)組和高表達(dá)組，中位OS分別為22.8個(gè)月(95%CI:18.9～26.8個(gè)月)和18.3個(gè)月(95%CI:14.8～21.9個(gè)月)，1年生存率分別為64.7%和56.2%；3年生存率分別為20.6%和6.2%。經(jīng)Log rank檢驗(yàn)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)，見圖1。本組病例中位無進(jìn)展生存期(PFS)為8.6個(gè)月(95%CI:6.3～10.9個(gè)月)。CTC低表達(dá)組和高表達(dá)組，中位PFS分別為11.5個(gè)月(95%CI:8.1～15個(gè)月)和5.6月(95%CI:2.9～8.2個(gè)月)；經(jīng)Log rank檢驗(yàn)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，見圖2。

表3 治療前后CTC表達(dá)水平的變化

圖1 晚期非小細(xì)胞肺癌CTC表達(dá)水平與生存期的關(guān)系

圖2 晚期非小細(xì)胞肺癌CTC表達(dá)水平 與無進(jìn)展生存期的關(guān)系

3 討 論

1869年，Ashworth因在癌癥死亡的患者外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤的細(xì)胞，提出了CTC的概念[5]。CTC定義為因內(nèi)在或外在原因，由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[6]。惡性腫瘤在增殖、發(fā)展過程中不斷有腫瘤細(xì)胞脫落，部分脫落的腫瘤細(xì)胞可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，在DNA水平、蛋白質(zhì)修飾及細(xì)胞表型上發(fā)生改變而具有侵襲性，從而能夠進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)，成為具有轉(zhuǎn)移能力的CTC[7]。

晚期NSCLC的治療目前仍以化療為主，相關(guān)性研究顯示CTC表達(dá)水平的變化與肺癌化療的療效呈負(fù)相關(guān)[5]。對于晚期初治、化療失敗的NSCLC患者而言，口服分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是可選治療方案之一。腫瘤細(xì)胞可通過調(diào)控EGFR的突變異常或過度表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞生長調(diào)節(jié)失控，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其不斷增殖[8]。EGFR-TKI通過阻斷酪氨酸激酶的自身磷酸化，抑制EGFR的過度表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[9]。EGFR突變陽性的患者使用EGFR-TKI治療后可獲得PFS及OS的獲益，目前已經(jīng)成為晚期NSCLC具有EGFR突變患者的一線治療方案。但在臨床中EGFR-TKI的應(yīng)用往往受限于隨后發(fā)生的耐藥，其T790M、MET擴(kuò)增等是誘發(fā)耐藥的主要原因[10]。如何在治療前和治療過程中采用相對微創(chuàng)方法來評估EGFR-TKI類藥物的療效及預(yù)后是一個(gè)難題。

近幾年來，以外周血為載體進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測及相關(guān)基因的表達(dá)越來越受到人們的重視。外周血、體液、胸腹腔積液等均可負(fù)載腫瘤細(xì)胞，具有腫瘤相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)，理論上可成為組織的替代物。但對CTC行基因檢測是否可以取代實(shí)體瘤基因檢測，仍存在爭議。Elizabeth等[11]發(fā)現(xiàn)接受EGFR-TKI治療的NSCLC患者的CTC攜帶的基因信息與腫瘤組織具有高度一致性。Yamamoto等[12]研究表明在CTC中存在EGFR、MET、T790M等基因突變，可通過對CTC行基因檢測來評估療效及預(yù)后。

NSCLC患者外周血中的CTC數(shù)量較少，即使對晚期患者仍難以檢測。由于這個(gè)原因，建立一種精確、可靠、可重復(fù)的技術(shù)方法從外周血檢測CTC尤為重要。目前CTC檢測常用方法主要有流式細(xì)胞儀、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，RT-PCR)，Cell SearchTM系統(tǒng)法[12]。這些技術(shù)方法可明顯提高CTC的檢出率。其中，流式細(xì)胞儀是一種高速細(xì)胞分析與分選技術(shù)。它可以執(zhí)行相同的細(xì)胞，主要利用熒光抗體染色，對細(xì)胞的化學(xué)和物理特性進(jìn)行多參數(shù)分析[13]。因?yàn)槠浜唵?，可靠，快速的特性，已成為目前檢測CTC的主要技術(shù)。

本項(xiàng)研究以晚期NSCLC患者的外周血為載體，利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行CTC表達(dá)水平的檢測。本研究結(jié)果顯示：晚期NSCLC患者口服EGFR-TKI后CTC低表達(dá)組有效率為53.3%,疾病控制率為80.0%；CTC高表達(dá)組有效率為27.8%，疾病控制率為44.4%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EGFR-TKI治療有效的患者,治療前后CTC的表達(dá)水平變化明顯，治療后比治療前明顯下降；而EGFR-TKI治療無效的患者，治療前后CTC的表達(dá)水平變化不明顯；說明CTC表達(dá)水平的變化與EGFR-TKI的療效呈負(fù)相關(guān)，CTC表達(dá)水平的變化可以作為晚期NSCLC患者EGFR-TKI療效的預(yù)測指標(biāo)。這與Maheswaran等[14]和Nagrath等[15]研究顯示的在EGFR-TKI治療過程中監(jiān)測發(fā)現(xiàn)CTC表達(dá)的改變可以反映患者病情的變化趨勢和治療療效的結(jié)果是一致的。

本研究結(jié)果還顯示：CTC低表達(dá)組和高表達(dá)組，中位OS分別為22.8個(gè)月(95%CI:18.9～26.8個(gè)月)和18.3個(gè)月(95%CI:14.8～21.9個(gè)月)，1年生存率分別為64.7%和56.2%；3年生存率分別為20.6%和6.2%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。中位PFS分別為11.5個(gè)月(95%CI:8.1～15.0個(gè)月)和5.6個(gè)月(95%CI:2.9～8.2個(gè)月)；兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。這可能是因?yàn)镃TC低表達(dá)組相比CTC高表達(dá)組具有更好的EGFR-TKI療效及疾病控制率，從而為患者帶來了更好的OS及PFS。說明CTC的表達(dá)水平與EGFR-TKI治療的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，CTC低表達(dá)者較高表達(dá)者有更長的總生存期和無疾病進(jìn)展生存期，CTC表達(dá)水平的變化可以作為晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

目前多數(shù)研究認(rèn)為，CTC表達(dá)水平的變化可以作為預(yù)測腫瘤患者療效及預(yù)后的指標(biāo)。通過本試驗(yàn)研究顯示，CTC表達(dá)水平的變化與EGFR-TKI治療的療效及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，可以作為老年晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療的療效及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

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Study on relationship between efficacy of EGFR-TKI and circulating tumor cell in elderly patient with advanced non-small cell lung cancer*

HeWenjie1,JiangBo1△,JinCongguo2,TuChangling1,ZhuYing1,ChenXiaoqun2

(1.DepartmentofCadres′MedicalTreatment;2.TumorResearchInstitute,ThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650118,China)

Objective To investigate the association between the efficacy with epdidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor(EGFR-TKI) and the expression of circulating tumor cells(CTC)in elderly patient with advanced non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods Sixty-six elderly patients with advanced NSCLC were included.The median of expression number of CTC in all cases served as the cut-off point.The patients were divided into the CTC high expression group and CTC low expression group according to whether being higher or lower than the median.The two groups were given EGFR-TKKI medication therapy.The effects and prognosis were compared between the two groups.The survival analysis adopted the Kaplan-Meier method,Logrank test and Cox multivariate regression analysis.Results The efficacy rate of the CTC low expression group was 53.3%(16/30),whereas which of the CTC high expression group was 27.8%(10/36)，the difference was statistically significant(P<0.05).The median overall survival time in the CTC low expression group and CTC high expression group were 22.8 months(95%CI:18.9-26.8 months)and 18.3 months(95%CI:14.8-21.9 months)respectively.The median progression-free survival time was 11.5 months(95%CI:15.0-8.1 months)and 5.6 months(95%CI:2.9-8.2 months)respectively,the difference between the two groups was statistically significant(P<0.05).Conclusion The change of CTC expression level is negatively correlated with the efficacy and prognosis of EGFR-TKI therapy and can serve as the predictive indexes of efficacy and prognosis in elderly patients with advanced NSCLC.

cancer，non-small cell lung;circulating tumor cell;epdidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.015

云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(2012FB164)。 作者簡介：何文杰(1979-),主治醫(yī)師,博士,主要從事肺癌的內(nèi)科治療及研究?！?/p>

E-mail:jiang-bo@csco.org.cn。

R

A

1671-8348(2016)32-4507-04

2016-04-08

2016-05-21)