董陳誠(chéng),鐘 漓,張廣鈺,王振冉,冉福林,陳 霄

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西桂林 541002)

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論著·基礎(chǔ)研究

芒柄花黃素對(duì)人胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及機(jī)制研究*

董陳誠(chéng),鐘 漓△,張廣鈺,王振冉,冉福林,陳 霄

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西桂林 541002)

目的 研究芒柄花黃素對(duì)人胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及作用機(jī)制。方法 建立人胃癌MKN-45細(xì)胞荷瘤裸鼠癌癥模型，經(jīng)環(huán)磷酰胺(20mg/kg)和芒柄花黃素(10、20、40mg/kg)干預(yù)14d，觀察荷瘤重量變化及應(yīng)用TUNEL染色評(píng)估荷瘤組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量，并用蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)荷瘤內(nèi)源性p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及細(xì)胞周期蛋白(CyclinD)表達(dá)。結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，芒柄花黃素明顯抑制胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)(P<0.01)，并且腫瘤組織中細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)增加(P<0.01)。同時(shí)，芒柄花黃素干預(yù)組腫瘤組織中的p38MAPK蛋白表達(dá)增加,CyclinD蛋白水平減少 (P<0.01)。結(jié)論 芒柄花黃素具有明顯抑制胃癌細(xì)胞MKN-45增殖作用，其機(jī)制與激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

芒柄花黃素；胃腫瘤；細(xì)胞凋亡

胃癌病死率較高，是僅次于食道癌的常見惡性腫瘤之一[1]。當(dāng)前，胃癌治療一般采用手術(shù)、放射或化學(xué)療法，但進(jìn)展期胃癌的單純手術(shù)治療可能會(huì)存在肉眼或鏡下殘留灶，使復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率大大增加[2]。目前臨床上使用的烷化劑類抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺，在肝微粒體酶系催化下代謝轉(zhuǎn)化為烷化作用更強(qiáng)的氯乙基磷酰胺，能發(fā)揮細(xì)胞毒作用而殺滅腫瘤細(xì)胞，但其有著毒副作用較大的缺點(diǎn)[3]。近年發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，因此抑制該信號(hào)通路是藥物抗癌作用的新導(dǎo)向[4]。芒柄花黃素，又名刺芒柄花素，具有抗癌藥理活性，可防治前列腺癌及乳腺癌等癌癥，同時(shí)具有降血脂和抗氧化作用[5]。本實(shí)驗(yàn)首先建立人胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠動(dòng)物模型，然后探討芒柄花黃素對(duì)胃腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性，進(jìn)而闡明其抗癌作用機(jī)制并為今后的臨床開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 MKN-45人胃癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫(kù)。將MKN-45培育在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，150 U/mL青霉素和120 U/mL的鏈霉素)，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。雄性BALB/c裸鼠，18～20 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)在良好的實(shí)驗(yàn)控制環(huán)境中，標(biāo)準(zhǔn)化的飼料喂養(yǎng)和科學(xué)化的管理。

1.2 藥物與試劑 芒柄花黃素(純度大于98.0%)：上海佳和生物科技有限公司。環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。DMEM培養(yǎng)基：美國(guó)Gibico公司。胎牛血清：美國(guó)Gibico公司。胰蛋白酶：上海Sigma-Aldrich公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)研究所。DAB(3，3-二氨基聯(lián)苯胺)染色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。p38分裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)、細(xì)胞周期蛋白(CyclinD)及磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上海Sigma-Aldrich公司。蛋白裂解液:上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 HWS-150恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。 Series8000 直熱式CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)。W-CJ-1CU雙人單面水平超凈工作臺(tái)(南京萊步儀器有限公司)。SpectraMax 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。 DM IRB(型號(hào))倒置顯微鏡(德國(guó)Leica儀器有限公司)。ECL(電子化學(xué)發(fā)光)檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Scientific公司)。GelDoc 2000 伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 荷瘤動(dòng)物與藥物干預(yù) 將0.1 mL無(wú)菌MKN-45細(xì)胞(3×107個(gè)/mL)皮下注射到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。當(dāng)移植腫瘤長(zhǎng)到直徑約20 mm時(shí)，MKN-45荷瘤裸鼠被分為5組：模型對(duì)照組，環(huán)磷酰胺(20 mg/kg)陽(yáng)性組和芒柄花黃素(10、20、40 mg/kg)給藥組，每天腹腔注射1次，持續(xù)14 d。同時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)裸鼠體質(zhì)量(W)與腫瘤質(zhì)量，并計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(1-W給藥/W模型)×100%。

1.4.2 指標(biāo)檢測(cè) 分離皮下肝癌腫瘤組織，應(yīng)用TUNEL染色評(píng)估腫瘤組織中細(xì)胞凋亡數(shù)，并用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)腫瘤內(nèi)源性p38MAPK及CyclinD蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟操作均按照試劑供應(yīng)商說(shuō)明書嚴(yán)格進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 芒柄花黃素對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤增殖的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芒柄花黃素能抑制胃癌細(xì)胞MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，隨著芒柄花黃素濃度的增加腫瘤質(zhì)量不斷減小，呈劑量依賴性，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 芒柄花黃素抑制MKN-45荷瘤裸鼠 腫瘤增殖

*：P<0.01，與對(duì)照組比較。

2.2 芒柄花黃素對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示，MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤組織中模型對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少。而芒柄花黃素(10、20、40mg/kg)組，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)隨濃度逐漸增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 芒柄花黃素增加MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量

*：P<0.01，與對(duì)照組比較。

2.3 芒柄花黃素對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤組織CyclinD及p38MAPK蛋白表達(dá)的影響Westernblot結(jié)果表明，MKN-45荷瘤裸鼠內(nèi)源性p38MAPK表達(dá)較低，處于抑制其表達(dá)狀態(tài)，而CyclinD蛋白表達(dá)較高。經(jīng)芒柄花黃素干預(yù)后，腫瘤組織中p38MAPK蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而CyclinD蛋白水平明顯減少，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖1 芒柄花黃素增加荷瘤裸鼠腫瘤組織p38MAPK水平及下調(diào)CyclinD表達(dá)

3 討 論

目前，胃癌的病因至今未被完全闡明，但與直接或長(zhǎng)期破壞胃黏膜屏障導(dǎo)致促癌因子被激活有關(guān)[6]。在癌變發(fā)展中，癌細(xì)胞失控生長(zhǎng)會(huì)逐漸形成惡性癌，并進(jìn)一步侵入附近組織[7]。目前的臨床化療藥物療效有限，并有很大的毒副作用。因此，尋找能抑制腫瘤生長(zhǎng)并且高效低毒的藥物一直是近年研究的熱點(diǎn)。

在本研究中，以環(huán)磷酰胺和芒柄花黃素作用于MKN-45荷瘤裸鼠模型，結(jié)果相比MKN-45荷瘤裸鼠模型對(duì)照組，環(huán)磷酰胺和芒柄花黃素組的荷瘤裸鼠腫瘤組織減小，且腫瘤增殖抑制率與芒柄花黃素的劑量成正比，說(shuō)明了芒柄花黃素能有效發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。在接下來(lái)的腫瘤組織TUNEL染色實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)，MKN-45荷瘤裸鼠模型對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，而環(huán)磷酰胺和芒柄花黃素組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，并且呈劑量依賴性，這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示芒柄花黃素可能是通過(guò)誘導(dǎo)MKN-45細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。

研究表明，p38MAPK激活時(shí)發(fā)生核轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，同時(shí)p38通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程通過(guò)細(xì)胞周期起作用，因此p38信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[8]。而CyclinD是調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白之一，當(dāng)其過(guò)度表達(dá)可縮短G1期，并減少細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴性。研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)較高，同時(shí)其陽(yáng)性表達(dá)與癌癥的惡性程度呈正相關(guān)性，其中CyclinD通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)MAPK途徑發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移趨勢(shì)[9]。因此，調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號(hào)通路或減少CyclinD表達(dá)有助于控制胃癌的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上的研究成果是相一致的。本研究中，經(jīng)10、20、40mg/kg濃度的芒柄花黃素干預(yù)后，裸鼠腫瘤組織中p38MAPK蛋白水平明顯上調(diào)，而CyclinD蛋白水平降低，腫瘤增殖受到明顯抑制，因此筆者推測(cè)芒柄花黃素抑制胃癌細(xì)胞MKN-45增殖活性與激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，通過(guò)本研究，證明了芒柄花黃素能抑制胃癌細(xì)胞MKN-45生長(zhǎng)，其作用機(jī)制與激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，為下一步臨床應(yīng)用于胃癌的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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Inhibitory effect and mechanism of formononetin on nude mouse model bearing human gastric cancer cells MKN-45*

DongChencheng,ZhongLi△,ZhangGuangyu,WangZhenran,RanFulin,ChenXiao

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity，Guilin，Guangxi541002，China)

Objective To investigate the inhibitory effect of formononetin on the nude mouse model bearing human gastric cancer cells MKN-45 and its possible mechanism.Methods The nude mouse cancer model bearing human gastric cancer cells MKN-45 was established.Then the weight change of tumor bearing mouse was observed after 14 d intervention by 20 mg/kg of cyclophosphamide and 10,20,40 mg/kg of formononetin.The cellular apoptosis count was evaluated by using the TUNEL staining method.The endogenous p38MAPK and CyclinD protein expressions in tumor tissue were determined through the Western blot assay.Results Compared with model control group,formononetin significantly inhibited the growth of nude mouse bearing gastric cancer cells MKN-45 (P<0.01),moreover the cellular apoptotic count was increased (P<0.01).Meanwhile,expression of P38MAPK protein in the tumor tissue of formononetin intervention group was increased and the CyclinD protein level was decreased (P<0.01).Conclusion Formononetin has obviously inhibitory effect on the proliferation of gastric cancer cells MKN-45,its mechanism may be related with the activation of intracellular MAPK signal transduction pathway and inducing cellular apoptosis.

formononetin;gastric neoplasms;cellular apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.006

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(LX2014270)。 作者簡(jiǎn)介：董陳誠(chéng)(1981-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事胃腸腫瘤外科的研究?！?/p>

E-mail：zhongli0302@163.com。

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A

1671-8348(2016)32-4482-02

2016-05-18

2016-08-06)