王玉春，張 雪，駱雪萍△

(桂林醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.重癥醫(yī)學(xué)科，廣西桂林 541199)

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論著·基礎(chǔ)研究

VGX-1027對(duì)光滑念珠菌刺激大鼠氣道上皮細(xì)胞IL-1β和TNF-α表達(dá)影響的研究*

王玉春1，張 雪2，駱雪萍2△

(桂林醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.重癥醫(yī)學(xué)科，廣西桂林 541199)

目的 探討未加免疫抑制劑VGX-1027大鼠氣道上皮細(xì)胞(RTEC)與加入VGX-1027的RTEC分別與光滑念珠菌孵育后炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)及意義。方法 以體外培養(yǎng)未加VGX-1027孵育的RTEC(未加組)和加入VGX-1027孵育的RTEC(加入組)，分別與光滑念珠菌孵育3、6、9 h，觀察未加和加入組RTEC形態(tài)變化；Real time PCR檢測(cè)未加和加入組IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)；ELISA檢測(cè)未加和加入組IL-1β和TNF-α分泌。未與光滑念珠菌孵育并未加VGX-1027的RTEC為對(duì)照組。結(jié)果 隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)，IL-1β和TNF-α 表達(dá)呈進(jìn)行性增高，未加組與加入組相比，未加組IL-1β和TNF-α 表達(dá)更高。相同時(shí)間點(diǎn)，未加組與加入組比較IL-1β和TNF-α 表達(dá)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 RTEC可識(shí)別光滑念珠菌啟動(dòng)天然免疫，并激活下游炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，但是過(guò)度的炎癥反應(yīng)不能起到保護(hù)作用反而加重?fù)p傷。

光滑念珠菌；大鼠氣道上皮細(xì)胞；VGX-1027；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素1β

近年，由于未能控制的重癥感染誘導(dǎo)大量炎癥因子的釋放，使機(jī)體發(fā)生失控的自我持續(xù)放大和自我破壞的全身性炎癥反應(yīng)。全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)與代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)的失衡是多器官功能障礙綜合征(MODS)的主要發(fā)病機(jī)制[1]。其中，重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者由于光滑念珠菌等真菌感染導(dǎo)致菌血癥和膿毒敗血癥從而引起大量炎癥因子的釋放，使炎癥反應(yīng)失衡而死亡[2]。本研究通過(guò)培養(yǎng)未加免疫抑制劑N-乙酰-3,5-二碘-L-酪氨酸(VGX-1027)[3]的大鼠氣道上皮細(xì)胞(RTEC)和加入VGX-1027的RTEC分別與光滑念珠菌孵育，探討在免疫調(diào)節(jié)劑作用下，光滑念珠菌對(duì)RTEC刺激下加入組和未加組炎癥因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)及影響。

1 材料與方法

1.1 材料 RTEC購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。DMEM F12 1∶1混合培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)條件37 ℃、5%CO2。標(biāo)準(zhǔn)光滑念珠菌，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。接種沙堡培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h，挑菌落在高溫高壓滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，配成懸液，顯微鏡計(jì)數(shù)，無(wú)菌PBS重懸，4 ℃存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RTEC與光滑念珠菌孵育實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 孵育前準(zhǔn)備 細(xì)胞用胰酶消化、離心、計(jì)數(shù)，調(diào)整密度5×105/mL，每孔1 mL細(xì)胞懸液分別加入6孔板，培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2 孵育實(shí)驗(yàn)及分組 稀釋菌液，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度5×106/mL，每孔100 μL菌液，孵育復(fù)數(shù)(MOI)為1[4]。向六孔板任意一孔加菌液后，每間隔3 h，從其他六孔板任選一孔加菌液，共加3次，分別標(biāo)記未加(VGX-1027孵育)3、6、9 h組。從剩余孔中選取1孔，未與光滑念珠菌孵育并未加VGX-1027的RTEC標(biāo)記對(duì)照組。

1.2.1.3 加入抑制劑VGX-1027 按照1.2.1.1操作后，調(diào)整VGX-1027濃度為1 mg/mL[3]分別加入每1個(gè)孔，隨機(jī)選取3個(gè)孔按照1.2.1.2操作加菌液，標(biāo)記加入3、6、9 h組。

1.2.2 熒光定量PCR 檢測(cè)IL-1β和TNF-α 終止孵育，收集細(xì)胞加入1 mL Trizol，按說(shuō)明書提取RNA配制逆轉(zhuǎn)錄體系，合成cDNA第一鏈。IL-1β引物序列如下，上游：5′-ACC TGG TAG AAG TGA TGC C-3′，下游：5′-CAA GGA GTT GTT TCC GTT A-3′；TNF-α引物序列如下，上游：5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT-3′，下游：5′-AGA TGA TCT GAG TGT GAG GGT C-3′；β-acting引物序列如下，上游：5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′，下游：5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′。Real time PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 2 s，40循環(huán)。

1.2.3 上清液ELISA 檢測(cè)IL-1β和TNF-α 終止孵育，分別取100 μL上清液，按說(shuō)明進(jìn)行，繪制曲線，計(jì)算出IL-1β和TNF-α表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1RTEC光鏡觀察

2.1.1 未加組的RTEC光鏡觀察 對(duì)照組RTEC形狀完整、結(jié)構(gòu)清晰(圖1A)；未加3、6、9h組(圖1B、C、D)可見，RTEC形狀變異、邊緣模糊、結(jié)構(gòu)不完整，未加3h組與對(duì)照組比較，未加6h組與未加3h組比較，未加9h組與未加6h組比較，光滑念珠菌菌群數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞碎片、溶解現(xiàn)象更明顯。

2.1.2 加入組的RTEC光鏡觀察 由1圖E、F、G可見，加入3h組與未加3h組比較、加入6h組與未加6h組比較、加入9h組與未加9h組比較發(fā)現(xiàn)，加入組RTEC形狀、結(jié)構(gòu)和完整性均比未加入組損傷減輕，細(xì)胞變異減少，隨時(shí)間延長(zhǎng)光滑念珠菌數(shù)量逐漸增多，但細(xì)胞碎片和細(xì)胞溶解現(xiàn)象比未加組明顯減少。

A:對(duì)照組；B:未加3h組；C：未加6h組；D:未加9h組；E：加入3h組；F：加入6h組；G:加入9h組。

圖1RTEC與光滑念珠菌孵育光鏡觀察(×20)

2.2IL-1β和TNF-αmRNA熒光定量PCR結(jié)果

2.2.1 未加3、6、9h組與光滑念珠菌孵育后IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá) 未加3h組與對(duì)照組比較、未加6h組與未加3h組比較、未加9h組與未加6h組比較，IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)均明顯增高。

2.2.1.1 未加3、6、9h組IL-1βmRNA表達(dá) 未加3h組(2.498 5± 0.120 5)與對(duì)照組(1.000 0±0.000 0)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未加6h組(3.898 1± 0.141 1)與未加3h組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未加9h(5.942 1±0.110 7)與未加6h組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2.1.2 未加3、6、9h組TNF-αmRNA表達(dá) 未加3h組與對(duì)照組(1.000 0± 0.000 0)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未加6h組(6.298 9± 0.109 7)與未加3h組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未加9h組(8.785 7±0.517 3)與未加6h組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2.2 加入與未加3、6、9h組的RTEC與光滑念珠菌孵育后IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)水平 相同時(shí)間，加入組IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)降低(P<0.05)，尤其是加入9h組與未加9h組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2、3和表1、2。

圖2 加入VGX-1027組與未加組比較IL-1β mRNA表達(dá)

圖3 加入VGX-1027孵育組與未加組比較TNF-α mRNA表達(dá)

2.3ELISA檢測(cè)上清液中IL-1β和TNF-α分泌

2.3.1 未加3、6、9h組上清液IL-1β和TNF-α因子的分泌 未加3h組與對(duì)照組比較、未加6h組與未加3h組比較，未加9h組與未加6h組比較，IL-1β和TNF-α的表達(dá)顯著升高。

2.3.1.1 未加3、6、9h組上清液IL-1β因子表達(dá) 未加3h組(121.53±15.71)與對(duì)照組(64.75±8.03)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未加6h組(272.94±7.72)與未加3h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未加9h組(412.55±19.05)與未加6h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3.1.2 未加3、6、9h組上清液TNF-α表達(dá) 未加3h組(80.69±8.57)與對(duì)照組(50.97±2.74)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未加6h組(139.13±15.78)與未加3h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未加9h組(307.79±18.81)與未加6h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3.2 加入與未加3、6、9h組上清液中IL-1β和TNF-α分泌比較 相同時(shí)間，加入組比未加組IL-1β和TNF-α的分泌均較低，尤其是9h組低表達(dá)更顯著(表3、4)。

表1 加入VGX-1027孵育組與未加組比較IL-1β mRNA表達(dá)

a：P<0.05，與加入3h組比較;b：P<0.05，與加入6h組比較;c：P<0.01，與加入9h組比較.

表2 加入VGX-1027孵育組與未加組比較TNF-α mRNA表達(dá)

a：P<0.05，與加入3h組比較;b：P<0.05，與加入6h組比較;c：P<0.01，與加入9h組比較。

表3 加入VGX-1027孵育組與未加組比較IL-1β分泌

a：P<0.05，與加入3h組比較;b：P<0.05，與加入6h組比較;c：P<0.01，與加入9h組比較。

表4 加入VGX-1027組與未加組比較TNF-α分泌

a：P<0.05，與加入3h組比較;b：P<0.05，與加入6h組比較;c：P<0.01，與加入9h組比較。

3 討 論

VGX-1027是一種異惡唑化合物，有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)特性，能針對(duì)體內(nèi)外不同受體信號(hào)通路刺激抑制炎癥因子的分泌[5]。有研究表明，VGX-1027是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，能降低促炎細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α和干擾素γ(INF-γ)等的分泌，并通過(guò)抑制細(xì)胞因子的炎性作用使細(xì)胞存活率顯著增加[3]，從而避免炎性-抗炎失衡對(duì)機(jī)體造成的嚴(yán)重?fù)p傷。對(duì)于ICU患者由于大量激素和免疫抑制劑的應(yīng)用，真菌侵入機(jī)體發(fā)生侵襲性肺部真菌感染(IPFI)非常普遍[6]。嚴(yán)重的未能控制的真菌感染引起大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)釋放，使炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)失衡造成嚴(yán)重的肺臟損傷最終導(dǎo)致死亡。本研究通過(guò)RTEC加入免疫抑制劑VGX-1027與光滑念珠菌孵育相同時(shí)間發(fā)現(xiàn)，信號(hào)通路下游炎癥因子IL-1β和TNF-α分泌與未加入組相比顯著減少。此時(shí)在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，加入組與未加入組相比，加入組細(xì)胞輪廓、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和完整性破壞情況比不加入組明顯減輕。由此可見，VGX-1027具有很強(qiáng)的免疫抑制性，可降低炎性介質(zhì)IL-1β和TNF-α的分泌，減輕炎癥反應(yīng)，避免失控的炎癥反應(yīng)帶來(lái)的嚴(yán)重?fù)p傷。

當(dāng)真菌入侵機(jī)體時(shí)，首先接觸氣道上皮細(xì)胞，氣道上皮細(xì)胞是抵抗真菌等病原微生物入侵機(jī)體的第一道防線[7]，也是抗病原微生物感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答的前哨細(xì)胞。以往氣道上皮細(xì)胞僅被認(rèn)為是機(jī)械物理屏障，隨研究深入發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞表面存在許多特異的病原識(shí)別受體(PRRs)，如Toll樣家族受體[8]和C型凝集素受體(CLR)等，通過(guò)對(duì)真菌表面病原相關(guān)分子模式(PAMPs)識(shí)別啟動(dòng)天然免疫，保護(hù)機(jī)體免受真菌侵襲[9]。PRRs通過(guò)特異識(shí)別PAMP后，活化信號(hào)通路，招募特異接頭蛋白如MyD88等，使下游炎癥和趨化因子釋放，發(fā)揮抗真菌感染作用[10-11]。Dubourdeau等[12]發(fā)現(xiàn)用分生孢子刺激小鼠能激活信號(hào)通路啟動(dòng)天然免疫，誘導(dǎo)下游TNF-α和IL-1等分泌抗感染。又有研究發(fā)現(xiàn)，PRRs上調(diào)也可以促進(jìn)炎癥因子如TNF-α等的分泌，增加抗感染作用[13]。本實(shí)驗(yàn)研究同樣發(fā)現(xiàn)，光滑念珠菌與RTEC孵育能誘導(dǎo)下游炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，未加組炎癥因子分泌比加入組多。其中，最明顯的現(xiàn)象是雖然未加3h組比加入3h組釋放的炎癥因子IL-1β和TNF-α明顯增多，但此時(shí)在顯微鏡卻發(fā)現(xiàn)與加入3h組相比未加3h組RTEC細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和完整性的損害相對(duì)較輕，細(xì)胞溶解和細(xì)胞碎片相對(duì)較少。由此可見，在真菌感染早期信號(hào)通路能啟動(dòng)天然免疫，誘導(dǎo)下游炎癥因子如TNF-α和IL-1β的釋放，適度的炎癥反應(yīng)能抗真菌感染。

然而隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，下游的炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)逐漸增多，尤其在9h組。未加9h組比加入9h組IL-1β和TNF-α的分泌幾乎升高了一倍，但此時(shí)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，未加組與加入組相比未加組RTEC受到的損害不但沒有減輕反而加重。細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性均被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞溶解、被吞噬現(xiàn)象越來(lái)越明顯，細(xì)胞碎片逐漸增多。張青等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α是SIRS主要的前炎癥細(xì)胞因子，當(dāng)一個(gè)損害性刺激作用機(jī)體會(huì)誘導(dǎo)前炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，“瀑布樣”效應(yīng)開始啟動(dòng)?；颊哐獫{中前炎癥因子IL-1β和TNF-α等水平顯著升高，使機(jī)體的炎癥反應(yīng)逐漸擴(kuò)大，甚至失控。對(duì)于重癥患者在器官損害期，前炎癥細(xì)胞因子會(huì)顯著升高，導(dǎo)致組織損傷和器官功能障礙[15]。此時(shí)，重癥患者將加重病情甚至死亡。由此證明，過(guò)度失控的炎性因子釋放會(huì)產(chǎn)生瀑布級(jí)聯(lián)，引起機(jī)體失控的自我持續(xù)放大和自我破壞的全身性炎癥反應(yīng)加重?fù)p傷。

綜上所述，RTEC能識(shí)別光滑念珠菌，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)下游炎性因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，從而啟動(dòng)天然免疫抗真菌感染。適度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用，但失控的持續(xù)放大的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷更為嚴(yán)重。因此，充分認(rèn)識(shí)炎癥避免“二次打擊”可能為ICU重癥患者在治療方面提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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Study of effect of VGX-1027 on expression of IL-1β and TNF-α in rat tracheal epithelial cells stimulated by Candida glabrata*

WangYuchun1，ZhangXue2，LuoXueping2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofICU,SecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541199,China)

Objective To explore the expression and significance of IL-1β and TNF-α in rat tracheal epithelial cells(RTEC)without adding immunosuppressant VGX-1027 and RTEC with adding VGX-1027 after co-culturing with Candida glabrata.Methods RTEC without and with VGX-1027 were respectively co-cultured with Candida glabrata bacteria liquid for 3,6,9 h.Then the morphological changes of RTEC were observed in the adding VGX-1027 group and non-adding VGX-1027 group;the mRNA expressions of IL-1β and TNF-α were detected by real-time PCR and secretion of IL-1β and TNF-α was determined by ELISA．Results With the culture time extending,the expression of IL-1β and TNF-α showed the progressive increase;the expressions of IL-1β and TNF-α in the non-adding VGX-1027 group were higher than those in the adding VGX-1027 group.At the same time point,the expressions of IL-1β and TNF-α had statistically significant difference between the non-adding VGX-1027 group and adding VGX-1027 group(P<0.05).Conclusion RTEC can recognize Candida glabrata to activate natural immunity and secretion of downstream inflammatory factors IL-1β and TNF-α,and mediates inflammatory reaction,but excessive inflammation can not play a protective effect,on the contrary aggravates damage.

Candida glabrata；rat tracheal epithelial cells；VGX-1027；tumor necrosis factor-α；interleukin-1beta

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.004

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(重2012007)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013GXNSFAA019209)。 作者簡(jiǎn)介：王玉春(1965-)，副主任技師，本科，主要從事重癥感染方面研究?！?/p>

R519.3

A

1671-8348(2016)32-4475-04

2016-04-03

2016-05-16)