徐 敏，邱 雷，郭連峰，趙 寧，張憲軍△，張麗娟

(1.哈勵遜國際和平醫(yī)院醫(yī)?？?，河北衡水 053000；2.哈勵遜國際和平醫(yī)院病理科，河北衡水 053000；3.哈勵遜國際和平醫(yī)院檢驗科，河北衡水 053000；4.哈勵遜國際和平醫(yī)院婦科，河北衡水 053000；5.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,河北石家莊 050000)

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論著·基礎(chǔ)研究

AIF對人宮頸癌Hela細胞體外生物學活性的影響及機制研究*

徐 敏1，邱 雷2，郭連峰3，趙 寧4，張憲軍4△，張麗娟5

(1.哈勵遜國際和平醫(yī)院醫(yī)?？?，河北衡水 053000；2.哈勵遜國際和平醫(yī)院病理科，河北衡水 053000；3.哈勵遜國際和平醫(yī)院檢驗科，河北衡水 053000；4.哈勵遜國際和平醫(yī)院婦科，河北衡水 053000；5.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,河北石家莊 050000)

目的 探討凋亡誘導因子(AIF)對人宮頸癌Hela細胞體外生物學活性的影響及其作用機制。方法 通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體質(zhì)粒及pcDNA3-AIF質(zhì)粒于人宮頸癌Hela細胞，采用免疫熒光反應(yīng)，RealtimePCR及Westernblot法檢測細胞中AIF的表達。四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活力，AnnexinV-PI流式雙染及Hoechst染色檢測細胞凋亡情況，RealtimePCR及Westernblot法檢測細胞中腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)及核酸內(nèi)切酶G(EndoG)蛋白及mRNA的表達。結(jié)果 與pcDNA3組比較，pcDNA3-AIF組細胞中AIF主要定位于細胞核中，且細胞核中AIF蛋白及mRNA表達量皆顯著提高(P<0.01)，同時細胞活力下降，細胞凋亡率提高(P<0.01)，細胞中PARP-1、EndoG蛋白及mRNA表達量顯著提高(P<0.01)。結(jié)論AIF具有促進宮頸癌Hela細胞凋亡的作用，可能與PARP-1/AIF/EndoG信號通路有關(guān)。

凋亡誘導因子；宮頸腫瘤；Hela細胞；凋亡；腺苷二磷酸核糖聚合酶-1；核酸內(nèi)切酶G

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居第2位[1-2]。宮頸癌的發(fā)病機制多樣，受多種因素影響，其中細胞凋亡與細胞增殖的失衡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。細胞凋亡主要有依賴性含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶3(Caspase 3)及非依賴性Caspase 3水解酶兩種途徑，其中凋亡誘導因子(AIF)通路是屬于后一種，是由線粒體途徑直接誘導細胞凋亡卻又獨立于Caspase 3途徑的一條信號通路[3-4]。已有報道AIF在包括宮頸癌、胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-7]，但AIF在宮頸癌中的作用機制尚未見報道，因此本研究擬闡述AIF對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細胞Hela購于中國科學院細胞庫，目錄號：TCHu187。主要試劑和儀器：兔抗AIF，PARP-1，EndoG多克隆抗體購于美國Abcam公司；兔抗β-actin單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；Annexin V-PI流式雙染檢測試劑盒，Hoechst 33258染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；pcDNA3空載體質(zhì)粒及pcDNA3-AIF質(zhì)粒購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購于Gibco公司；胎牛血清，DMEM養(yǎng)基購于Hyclone公司。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀購于北京六一儀器廠公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司，AF6000熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將宮頸癌細胞Hela接種于96、24或6孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體質(zhì)粒(pcDNA3)及pcDNA3-AIF，轉(zhuǎn)染6 h后，棄去轉(zhuǎn)染液，并通過Realtime PCR，Western blot及免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 Real time PCR檢測AIF、PARP-1及Endo mRNA表達 采用Trizol法抽提細胞總RNA。通過一步法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并定量PCR檢測。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物如表1所示。反轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA模板2 μL(1 μg)、dNTP混合物2 μL、MgCl22 μL、加EDPC補充蒸餾水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)為40。以-△△CT值法計算靶基因的相對表達水平：3次平行重復實驗的平均值作為每個樣本的CT值，△CT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)，△△CT=△CT(樣本平均)-△CT(對照組)，因此目的基因相對表達水平=2-△△CT，對照組的相對表達量為20=1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 免疫熒光檢測 將Hela細胞加到24孔板的玻片上，24 h后，進行轉(zhuǎn)染，48 h后取出細胞爬片，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，再加入1% Triton X-100進行細胞穿膜處理30 min，PBS洗滌，加入1%牛血清室溫封閉1 h，接著加入兔抗人AIF多克隆抗體，4 ℃過夜，二抗(FITC標記)室溫孵育1 h。細胞核在室溫進行PI染色15 min，后于熒光顯微鏡下進行檢測。細胞核染為紅色，細胞膜染為綠色。

1.2.4 MTT法檢測Hela細胞活力 按“1.2.1”進行操作后，分別于24、48、72、96 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標儀490 nm處測光密度(OD)值，以O(shè)D值表示細胞相對活力。

1.2.5 Annexin V-PI流式雙染檢測Hela細胞凋亡 按“1.2.1”進行操作后，48 h后消化收集細胞，避光染色30 min上機檢測。按照Annexin V-FITC/ PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，在1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 Hoechst染色檢測Hela細胞凋亡 按“1.2.1”進行操作后，48 h后消化收集細胞，后按照Hoechst 33258染色試劑盒說明書進行操作，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Western blot檢測 按“1.2.1”進行操作后，48 h后消化收集細胞，加入RIPA裂解液，裂解細胞，吸取上清液即可獲得總蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性并上樣，進行十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。一抗孵育，4 ℃過夜；二抗室溫孵育1～2 h。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

2 結(jié) 果

2.1 AIF轉(zhuǎn)染的鑒定 pcDNA3組中AIF在細胞中呈點狀，主要位于細胞質(zhì)中，在轉(zhuǎn)染pcDNA3-AIF組中AIF蛋白已有大部分位于細胞核內(nèi)，見圖1。pcDNA3組及pcDNA3-AIF組細胞核中AIF蛋白及mRNA表達水平分別為[(0.19±0.02)vs. (0.95±0.09)，P=0.004]及[(0.27±0.03)vs. (0.88±0.09)，P=0.005]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖2。

圖1 AIF蛋白在Hela細胞中的表達及定位

圖2 AIF蛋白在Hela細胞中的表達

2.2 pcDNA3-AIF對Hela細胞活力的影響 在作用24、48、72、96 h時，與pcDNA3組比較，pcDNA3-AIF組細胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009，P=0.004，P=0.005，P=0.006)，見圖3。且在48、72、96 h時作用強度一致。

a：P<0.01，與pcDNA3組比較。

圖3 pcDNA3-AIF對Hela細胞活力的影響

2.3 pcDNA3-AIF對Hela細胞凋亡情況的影響 表2所示，經(jīng)流式雙染及Hoecsht染色發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3組比較，pcDNA3-AIF組細胞凋亡率顯著提高，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.003，P=0.005)，見圖4。

2.4 pcDNA3-AIF對Hela細胞核中PARP-1及EndoG表達的影響 與pcDNA3組比較，pcDNA-3-AIF組細胞核中PARP-1、EndoG蛋白(P=0.006，P=0.005)及mRNA表達均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.008，P=0.004)，見圖5、6。

A：流式細胞術(shù)檢測；B：Hoecsht染色檢測(×200)。

圖4 pcDNA3-AIF對Hela細胞凋亡情況的影響表2 pcDNA3-AIF對Hela細胞凋亡情況的影響

a：P<0.01，與pcDNA3組比較。

圖5 pcDNA3-AIF對Hela細胞核中PARP-1及EndoG蛋白表達的影響

a：P<0.01，與pcDNA3組比較。

圖6 pcDNA3-AIF對Hela細胞核中PARP-1及EndoG mRNA表達的影響

3 討 論

AIF是1996年由Susin等在采用Caspase光譜抑制劑z-VAD.fmk處理鼠肝細胞線粒體膜中發(fā)現(xiàn)的一種活動蛋白。AIF是一種黃素蛋白，人源AIF位于X染色體q25-26區(qū)。在正常生理狀態(tài)下，AIF定位于細胞線粒體膜間隙中，在外界凋亡信號刺激下，AIF將由線粒體膜進入細胞質(zhì)，繼而通過核定位信號進入細胞核，進而直接引起染色體聚集及DNA等大分子斷裂，導致細胞凋亡。說明說AIF對于細胞凋亡的影響不僅與其表達量有關(guān)，更主要的是看其所定位的亞細胞位置[8]。因此本研究首先轉(zhuǎn)染pcDNA3-AIF質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNA3-AIF組細胞中AIF主要定位于細胞核中，且蛋白及mRNA表達量顯著提高。同時代安亞等[8]研究結(jié)果表明，腺病毒載體轉(zhuǎn)染AIF到白血病K562能直接顯著的誘導細胞凋亡。趙悅等[9]的研究也表明真核表達載體pcDNA3-AIF能顯著的降低乳腺癌MCF細胞線粒體膜電位，提高細胞凋亡率。此現(xiàn)象說明過表達AIF可能誘導Hela細胞凋亡。所以本研究進一步通過MTT，流式雙染及Hoechst染色檢測轉(zhuǎn)染后兩組細胞凋亡率，結(jié)果表明pcDNA3-AIF組比pcDNA3組細胞活力顯著降低，細胞凋亡率上升，與代安亞等[8]、趙悅等[9]的研究結(jié)果一致，說明過表達AIF對Hela細胞凋亡起著促進作用。

已報道AIF不依賴于Caspase途徑，不受Bcl-2家族蛋白的影響，能夠由上游刺激信號腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)誘導，進而進行細胞凋亡的調(diào)控[11]。PARP-1是一種核蛋白酶，能參與細胞DNA損傷修復，基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄，蛋白降解等多種生理過程。PARP-1在正常生理條件下，與核纖層蛋白(laminB)共定位，在氧化應(yīng)激，機械力，化學誘導劑等刺激下，與laminB脫離并積聚于核仁，進而在DNA損傷修復中發(fā)揮作用，但是過度的DNA損傷及PARP-1表達，造成細胞內(nèi)NAD和ATP耗竭，能量的耗竭使得線粒體膜通透性增加，膜電位降低，并使線粒體腫脹破裂，使得AIF及EndoG從線粒體中釋放出來，進入細胞核，誘發(fā)非Caspase3途徑，最終導致細胞凋亡的產(chǎn)生[12]。Gerace等[12]將DNA烷化劑MNNG處理海馬神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)PARP-1被持續(xù)激活，AIF核轉(zhuǎn)位并積聚，細胞凋亡率顯著提高，而當轉(zhuǎn)染AIF抗體后，能顯著的抑制此變化。給予PARP-1抑制劑PJ34能顯著的抑制外傷性腦損傷引起的神經(jīng)細胞凋亡，并降低PARP-1表達，同時抑制AIF的核轉(zhuǎn)位[13]。說明通過上調(diào)細胞核中PARP-1表達，進而促進AIF的核轉(zhuǎn)位及在細胞核中的聚集，能顯著的誘導腫瘤細胞凋亡。因此，本研究采用Western blot檢測pcDNA3-AIF及pcDNA3轉(zhuǎn)染后，細胞核中PARP-1及AIF的表達，結(jié)果表明過表達pcDNA3-AIF組細胞核中PARP-1表達量及AIF顯著上調(diào)，提示過表達AIF亦能通過激活PARP-1/AIF途徑，從而誘導Hela細胞凋亡。此外在凋亡信號刺激下，線粒體特異性核酸酶EndoG能夠與AIF蛋白一起從線粒體釋放出來，引起細胞凋亡。謝丹等[14]研究表明通過使AIF定位于腫瘤細胞核中并在細胞核集聚，從而使AIF及EndoG表達上調(diào)，能顯著的遏制肝癌腫瘤的生長。所以本研究進一步通過Western blot檢測細胞核中EndoG的表達，結(jié)果表明pcDNA3-AIF組較pcDNA3組細胞核中EndoG1表達量顯著上調(diào)，從而說明通過提高AIF表達，能通過激活PARP-1/AIF/EndoG信號通路從而誘導Hela細胞凋亡。

綜上所述，通過促進宮頸癌Hela細胞中AIF的表達，能顯著的提高其上游蛋白PARP-1表達，并上調(diào)其下游蛋白EndoG表達，從而誘導細胞凋亡?？梢赃M一步采用Caspase抑制劑及PARP-1抑制劑處理細胞來進一步說明AIF對Hela細胞的凋亡誘導作用是獨立于此通路的，是通過PARP-1/AIF/EndoG信號通路實現(xiàn)的[14-16]。

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Study on effect and mechanism of AIF on in vitro biological activity of human cervical cancer Hela cells*

XuMin1,QiuLei2,GuoLianfeng3,ZhaoNing4,ZhangXianjun4△,ZhangLijuan5

(1.DepartmentofMedicalInsurance;2.DepartmentofPathology;3.DepartmentofClinicalLaboratory;4.DepartmentofGynecology,HarrisonInternationalPeaceHospital,Hengshui,Hebei053000,China;5.DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China)

Objective To explore effect of apoptosis inducing factor(AIF)on the in vitro biological activity of human cervical cancer Hela cells and its mechanism.Methods Hela cells were transferred with pcDNA3 plasmid and pcDNA3-AIF plasmid.The location and expression of AIF in Hela cell was determined by immunofluorescent,realtime PCR and Western blot.The cell viability was detected by MTT.The cell apoptosis was examined by Annexin V-PI flow cytometry and Hoechst staining.The expression of poly(ADP-ribose)polymerases-1(PARP-1)and endonuclease G(EndoG)was detected by Western blot.Results Compared with the pcDNA3 group,AIF in the pcDNA3-AIF group was mainly localized in the nucleus,moreover the expression of AIF protein and mRNA in nucleus was significantly increased(P<0.01),meanwhile the cell viability was decreased,cell apoptotic rate was increased(P<0.01),the expressions of PARP-1 and EndoG protein and mRNA were significantly increased(P<0.01).Conclusion AIF has the effect for promoting Hela cell apoptosis,which might be related to PARP-1/AIF/EndoG signal pathway.

apoptosis inducing factor;uterine cervical neoplasms;Hela cells;apoptosis;poly(ADP-ribose)polymerases-1;endonuclease G

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.003

國家自然科學基金資助項目(81100394)。 作者簡介：徐敏(1981-)，中級醫(yī)師，本科，主要從事婦產(chǎn)科疾病的研究?！?/p>

E-mail:xmlm520@163.com。

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A

1671-8348(2016)32-4471-04

2016-04-05

2016-05-18)