王艷玲，張紊瑋，楊麥娟，張琳苑

（1蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 蘭州 730050）（2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 蘭州 730070）

兩種馬鈴薯干腐病鐮刀菌的分離鑒定

王艷玲1，張紊瑋2，楊麥娟1，張琳苑1

（1蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 蘭州 730050）（2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 蘭州 730070）

本文從甘肅定西地區(qū)采集患有干腐病的馬鈴薯塊莖樣品中，以組織分離及單孢純化法分離到干腐病致病鐮刀菌19株，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征參照Nelson鐮刀菌分類系統(tǒng)進(jìn)行初步鑒定，并結(jié)合ITS序列測(cè)序鑒定為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）兩個(gè)種，為今后有針對(duì)性地篩選有效殺菌劑防治馬鈴薯干腐病降低儲(chǔ)藏期損失打下基礎(chǔ)。

馬鈴薯干腐病；鐮刀菌；ITS；菌種鑒定

馬鈴薯（Solonum tuberosum）是一種具有抗干旱、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)以及綜合加工用途很廣泛等優(yōu)勢(shì)的茄科作物[1]，已成為稻米、小麥、玉米之外又一主糧。馬鈴薯儲(chǔ)藏過程中所面臨一個(gè)嚴(yán)峻的問題——病害損失，然而最常見且最重要的一種儲(chǔ)藏期病害就是鐮刀菌干腐病[2,3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)馬鈴薯干腐病進(jìn)行研究，報(bào)道的病原各有不同[4,5]。甘肅是我國(guó)馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量和面積均居全國(guó)前列。但馬鈴薯塊莖在儲(chǔ)藏期間易發(fā)生腐爛，其中由鐮刀菌引起的干腐病是造成馬鈴薯腐爛最主要病害。因此，調(diào)查馬鈴薯干腐病在定西地區(qū)的發(fā)生并鑒定致病菌，為今后篩選有效殺菌劑、評(píng)價(jià)馬鈴薯種質(zhì)資源的抗病性、對(duì)有效防治馬鈴薯干腐病、降低儲(chǔ)藏期損失都具有十分重要的意義。

1、材料和方法

1.1 患病馬鈴薯塊莖樣品的收集

2013年9月在甘肅省定西地區(qū)收集患病馬鈴薯塊莖樣品，并將其用多層保鮮膜包裹，最后用紙袋包裝帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 致病菌的分離和鑒定

1.2.1 致病菌的分離和常規(guī)鑒定

自來(lái)水多次沖洗患病馬鈴薯塊莖，70%乙醇消毒3-5m in后，再次用無(wú)菌水將病薯沖洗干凈，然后用無(wú)菌刀片切取病變的馬鈴薯塊莖和正常的馬鈴薯塊莖交界處的染病組織，將其接種于PDA培養(yǎng)基（1000m l培養(yǎng)基配制；正常新鮮的馬鈴薯200g煮沸30m in,過濾棄渣，然后于濾液中加入葡萄糖20g和瓊脂14g，煮沸，分裝，121℃滅菌25m in）上，于26℃培養(yǎng)2d生長(zhǎng)出菌落。然后采用劃線法逐級(jí)分離單菌落。最后采用稀釋法進(jìn)一步進(jìn)行單孢純化。參照N elson分類系統(tǒng)，依照菌落顏色、形態(tài)、直徑；孢子和菌絲體形態(tài)及大小等進(jìn)行鑒定。

1.2.2 致病菌致病性的研究

選用健康且易染病的馬鈴薯，用75%酒精處理該馬鈴薯塊莖的表皮，然后用0.5cm打孔器在該塊莖上打孔，將PDA培養(yǎng)平板上的鐮刀菌制成孢子懸浮液接種于馬鈴薯塊莖內(nèi)，空白對(duì)照接種無(wú)菌水。接種完成后用保鮮膜包裹該馬鈴薯，放置于干燥陰暗的地方培養(yǎng)，15d后觀察發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌的分子鑒定

鐮刀菌的基因組采用CTAB法制備，采用鐮刀菌rDNA保守ITS序列兩端引物，上游引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ;下游引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；PCR擴(kuò)增條件：94℃5m in；94℃30s，56℃45S, 72℃80S, 35個(gè)循環(huán)72℃7m in，4℃30m in；PCR產(chǎn)物用Axyprep DNA 凝膠回收試劑盒純化回收，送到北京天一輝遠(yuǎn)生物有限公司測(cè)序。用DNAM AN軟件和GeneBank已知序列比對(duì)同源序列比對(duì)進(jìn)行鑒定。

2、結(jié)果與分析

2.1 鐮刀菌的分離純化

采用病樣分離培養(yǎng)及單孢分離純化的方法從25個(gè)薯塊分離中獲得具有明顯鐮刀菌特征的菌株2株。分別將這兩種菌株命名為F1和F2。菌株F1在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5天直徑為48m m，氣生菌絲呈羊毛狀，較濃密，菌落顏色為乳白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)菌落顏色變?yōu)榛野咨荒軌虍a(chǎn)生兩種分生孢子：小孢子產(chǎn)生早而多；單生于小型瓶梗上，0-1個(gè)分隔，以卵圓形居多。大孢子產(chǎn)生于多分枝的分生孢子梗上，呈月牙狀、微彎，較寬短；2-4個(gè)分隔，以3個(gè)分隔的占絕大多數(shù)（圖1A）。菌株F2在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5d直徑為54.5m m，氣生菌絲呈絨毛狀，稀疏，菌落顏色為淡粉色，隨著培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng)菌落顏色加深呈粉紅色。其產(chǎn)生的大型分生孢子通常3-5個(gè)隔膜。分生孢子座的產(chǎn)孢梗分枝或不分枝，單瓶梗。偶爾產(chǎn)生小型分生孢子，橢圓形，0-1個(gè)隔膜（圖1B）。依據(jù)以上的菌株的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征綜合分析，初步鑒定F1為腐皮鐮刀菌，F(xiàn)2為硫色鐮刀菌。

圖1 馬鈴薯干腐病病原菌F1，F(xiàn)2形態(tài) A：F1菌株菌落、菌絲體及分生孢子的形態(tài); B：F2菌株菌落形態(tài)、菌絲體及分生孢子的形態(tài)，F(xiàn)1, F2菌株均在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

2.2 鐮刀菌致病性分析

將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的鐮刀菌菌絲制成菌餅接種于易感染的馬鈴薯塊莖中，進(jìn)行致病性分析。結(jié)果表明在接種15d后，接入菌的有白色菌絲從小孔，形成典型干腐病病斑，而接入無(wú)菌水的對(duì)照孔沒有發(fā)生病變（圖2）。

圖2 鐮刀菌的致病性 A，B：F1和F2菌株致病馬鈴薯表面和內(nèi)部癥狀

2.3 鐮刀菌分子鑒定分析

2.3.1 兩種鐮刀菌rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增

以兩株鐮刀菌總DN A 基因組為模板，用鐮刀菌rDN A保守區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖3A,B）。從圖中可以看出擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和預(yù)計(jì)片段大小一致。然后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物回收和純化，并進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序。

圖3 鐮刀菌rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增 A：F1菌株 B：F2菌株

2.3.2 rDNA-ITS 序列測(cè)定與分析

采用DNA-M AN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果分析，結(jié)果表明獲得的片段同鐮刀菌的ITS1和ITS2及5. 8S在內(nèi)的rDNA-ITS片段相同。采用GeneBank的Blast功能對(duì)2株鐮刀菌rDNA-ITS的克隆片段進(jìn)行序列比較和分析，結(jié)果表明：F1菌株的ITS序列與腐皮鐮刀菌(Fusarium Solani) 相似度達(dá)到99%，F(xiàn)2菌株的ITS序列與硫色鐮刀菌 (Fusarium sulphureum)相似度達(dá)到100%。F1、F2根據(jù)ITS 的分子鑒定結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，確定F1和F2分別為腐皮鐮刀菌(Fusarium Solani)和硫色鐮刀菌(Fusarium sulphureum)。

3、討論和結(jié)論

不同國(guó)家和地區(qū)鐮刀菌的種類和致病性存在著很大的差異，目前我國(guó)不同地區(qū)馬鈴薯干腐病的致病菌也各不相同。浙江省馬鈴薯干腐病主要致病菌為腐皮鐮刀菌（茄病鐮刀菌）、串珠鐮刀菌、擬絲孢鐮刀菌及其變種等[6]，河北省地區(qū)主要的致病菌是茄病鐮刀菌和半裸鐮刀菌[7]。本研究從甘肅省白銀和定西地區(qū)分離到2種鐮刀菌，通過常規(guī)的方法及分子鑒定分別為：腐皮鐮刀菌和硫色鐮刀菌。腐皮鐮刀菌為全球分布相當(dāng)廣泛的一種鐮刀菌屬，一般從耕地、草原的土壤中均可以分離到，同時(shí)所耐受的溫度范圍也比較廣[8,9]。硫色鐮刀菌分布也較廣泛，從農(nóng)作物以及土壤中均能分離到。

[1] 徐坤，2002.馬鈴薯食品資源的開發(fā)利用.西昌農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),(2):47-51.

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[5] T heron DJ,1999.Fusarium dry rot of potatoes: etiology, epidemiology,toxicity and control,Bloemfontein: The University of the Orange Free State.

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[7] 彭學(xué)文，朱杰華．2008. 河北省馬鈴薯真菌病害種類及分布．中國(guó)馬鈴薯，22(1) : 31-33．

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甘肅省自然科學(xué)基金（N o: 148RJZA004）