李雪雁 趙拓 任海偉 竇俊偉

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

溫度和初始pH對植物乳桿菌LP1生長特性的影響

李雪雁 趙拓 任海偉 竇俊偉

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

從乳酸生成濃度、OD值和pH值等角度研究了從青貯秸稈中分離得到的植物乳桿菌LP1的生長特性。結(jié)果表明，植物乳桿菌LP1在pH值4.5～7.5可以生長且能產(chǎn)生一定量的乳酸，該菌株的最適宜生長溫度為30-37℃，42℃培養(yǎng)亦可生長，有一定耐高溫潛力。

植物乳桿菌; 溫度; pH值; 生長特性

青貯是在厭氧條件下通過乳酸菌快速發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使pH迅速下降創(chuàng)造酸性環(huán)境，從而抑制梭菌等有害微生物生長、保存原料營養(yǎng)成分的過程。因此，青貯成功與否與乳酸菌有很大關(guān)系。青貯中常見的乳酸菌包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）等[1]。 其中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、戊糖片球菌(Lactobacillus pentosaceus)等同型乳酸菌在發(fā)酵過程中起支配作用時，能更有效利用水溶性碳水化合物，pH下降更為迅速，伴隨更少的干物質(zhì)或能量的損失[2-3]。很多學(xué)者已將乳酸菌復(fù)合菌劑用作添加劑來提高青貯品質(zhì)，因此選擇生長性能好、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的優(yōu)良菌株尤為重要[4]。

本文以課題組分離篩選的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)為研究對象，考察其在不同溫度和初始pH條件下的生長情況，以期對青貯復(fù)合菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)是從玉米秸稈與白菜的混合青貯中分離得到，編號LP1。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母浸膏5g；葡萄糖20g；吐溫-80 1g；檸檬酸氫二氨2g；乙酸鈉5g；硫酸鎂0.1g；硫酸錳0.05g；磷酸氫二鉀2g；加蒸餾水至1000 mL，配制固體培養(yǎng)基時加入瓊脂15g[5]。

1.2 主要儀器與設(shè)備

智能生化培養(yǎng)箱（DHP-9082，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；SBA-40X生物傳感分析儀(SBA-40C，山東省科學(xué)院生物研究所)。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化與純化

將供試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，待MRS液體培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁取出。將活化的乳酸菌接種于MRS平板上反復(fù)劃線分離，直到獲得該菌的純培養(yǎng)。

1.3.2 不同溫度和初始pH生長試驗

在20、30、37、42和50℃五個溫度梯度和初始pH值3.5、4.5、5.5、6.5、7.5和8.5六個pH梯度下，按1%（體積比）的接種量接種活化菌種于150 mL經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理的MRS液體培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48h，并動態(tài)分析培養(yǎng)液的OD值、乳酸濃度和pH值。

2、結(jié)果與分析

2.1 溫度對植物乳桿菌的影響

由圖1可知，植物乳桿菌在50℃時的OD值基本保持穩(wěn)定不變，但在20℃、30℃和37℃條件下培養(yǎng)3h即進(jìn)入對數(shù)生長期，6-33h后逐漸趨于平緩，到達(dá)生長穩(wěn)定時期，33h后略微有所增加。42℃時培養(yǎng)的OD值增長速率低于20℃、30℃和37℃，對數(shù)生長期為3～12h，12h后該菌株生長速率放緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖1 不同溫度下植物乳桿菌中OD值的變化

圖2 不同溫度下植物乳桿菌中pH值的變化

圖3 不同溫度下植物乳桿菌乳酸濃度的變化

從pH值角度看（圖2），pH值變化趨勢與OD值變化相對應(yīng)，二者呈負(fù)相關(guān)，20℃、30℃、37℃時的pH值變化趨勢基本相同，且這三種溫度時的發(fā)酵液pH值下降速率較42℃時迅速，與圖1一致。50℃培養(yǎng)時pH值恒定，但36h后有所下降，這可能是生成的少量乳酸累積所致。

由圖3產(chǎn)乳酸情況可知，4 2℃時的產(chǎn)酸速率較快，且乳酸濃度在1120～1420mg/mL范圍內(nèi)平穩(wěn)增加，始終高于其余溫度條件；30℃時的產(chǎn)酸速率與42℃相近，但乳酸濃度略低于42℃；37℃時乳酸生成速率略低于30℃和42℃，但21h后也達(dá)到1000～1160mg/ mL濃度范圍，與30℃時接近。20℃培養(yǎng)時，乳酸濃度在初始階段的3～9h迅速增加，但9h后迅速下降至480mg/mL的較低值，21h后乳酸濃度恒定且略有上升，說明20℃不利于乳酸的生成積累。50℃時的乳酸濃度很低，這與圖1中較低OD值相一致，判定該菌株在50℃時不生長。

2.2 初始pH值對植物乳桿菌影響

由圖4可知，初始pH值7.5時，對數(shù)生長期為3～6h，之后進(jìn)入穩(wěn)定生長期；隨著初始pH的下降，乳酸菌生長速率受到負(fù)面影響，對數(shù)生長期時間推遲。當(dāng)菌株在初始pH值為3.5和8.5的強(qiáng)酸、堿環(huán)境中培養(yǎng)時，OD值始終處于較低水平。

由圖5可知，不同初始pH值培養(yǎng)的乳酸菌在繁殖過程中由于乳酸積累均會使pH值發(fā)生下降現(xiàn)象，培養(yǎng)21h后pH值不再變化；但值得注意的是，調(diào)節(jié)好pH值得培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后均有所下降，這可能是高溫滅菌所致。另一方面，偏堿性的培養(yǎng)環(huán)境下pH值下降速度較快，酸性環(huán)境下培養(yǎng)的pH值基本保持不變。

由圖6可知，菌株1在pH值4.5以上均能產(chǎn)生一定量的乳酸，其中pH值5.5時生成的乳酸濃度最高，隨著pH值得升高，乳酸濃度有所降低。該菌株在pH值3.5培養(yǎng)時，乳酸含量一直很低，可以判定植物乳桿菌在pH為3.5時不生長。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該菌株的乳酸累積爆發(fā)期在12h之后，21h后乳酸濃度大幅增加且趨于穩(wěn)定。

3、結(jié) 論

植物乳桿菌LP1受溫度和pH值等環(huán)境因素影響較大。在42℃培養(yǎng)時生長繁殖略微緩慢，但乳酸生成濃度較高，在30℃和37℃培養(yǎng)時生長速率最快，但產(chǎn)酸量略低于42℃，說明菌株1具有一定的耐高溫性，可以作為42℃時青貯用乳酸添加劑。植物乳桿菌LP1在pH值3.5和8.5環(huán)境中不生長，pH值5.5、6.5和7.5條件下產(chǎn)酸穩(wěn)定且濃度較高。

圖4 不同初始pH條件下植物乳桿菌OD值的變化

圖5 不同初始pH下植物乳桿菌中pH的變化

圖6 不同初始pH下植物乳桿菌乳酸濃度的變化

［1］Queiroz O C, Adesogan A T, Arriola K G, et al. Effect of a dualpurpose inoculant on the quality and nutrient losses from corn silage produced in farm-scale silos[J].Journal of Dairy Science,2012,95(6):3354-3362.

［2］（澳）凱澤. 頂級芻秣：成功的青貯[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008.

［3］Pang Huili, Zhang Meng, Qin Guangyong, et al. Identification of lactic acid bacteria isolated from corn stovers[J]. Animal Science Journal, 2011, 82(5):642-653.

［4］劉晶晶,高麗娟,師建芳,王小芬,袁旭峰,崔宗均.乳酸菌復(fù)合系和植物乳桿菌提高柳枝稷青貯效果[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2015,31(9):295-302.

［5］郭興華,凌代文.乳酸細(xì)菌現(xiàn)代研究實驗技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社,2013.