王克益 蘭州理工大學(xué) 楊晨光

（蘭州理工大學(xué)）

含提取大豆蛋白的載上皮細(xì)胞型微載體制備方法與工藝優(yōu)化

王克益 蘭州理工大學(xué) 楊晨光

（蘭州理工大學(xué)）

利用殼聚糖和大豆提取蛋白質(zhì)作為主要材料，運(yùn)用乳化交聯(lián)法，制備粒徑在17到25微米之間的微球。大豆蛋白交聯(lián)后的微載體內(nèi)部孔隙度為80.14%，優(yōu)于作為對(duì)照組的殼聚糖/明膠微載體。通過(guò)設(shè)計(jì)一組單因素實(shí)驗(yàn)，制備大豆蛋白交聯(lián)微載體的工藝最優(yōu)條件確定如下：大豆蛋白含量為62.5%，大豆蛋白和殼聚糖的比例是3：2到2：1之間，所制備的微載體外形和性能最佳。上皮細(xì)胞在大豆蛋白交聯(lián)微載體表面貼合并呈球形生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及顯微鏡觀察表明，大豆蛋白交聯(lián)的微載體具有優(yōu)秀的細(xì)胞親和力。進(jìn)一步的電子顯微鏡觀測(cè)表明，大豆蛋白交聯(lián)微載體的表面極其適合細(xì)胞貼附生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)表明，大豆蛋白可以作為一種更新更廉價(jià)的材料，去制備微載體。

大豆蛋白；微載體；乳化交聯(lián)；上皮細(xì)胞

1、簡(jiǎn)介

皮膚移植手術(shù)是一種可以替代壞死的皮膚手術(shù)[1]。殖皮手術(shù)需要培養(yǎng)大量的上皮細(xì)胞，以替換壞死的皮膚[2]。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，在實(shí)際手術(shù)中需要制備一種與上皮細(xì)胞親和性較好，并且可以使上皮細(xì)胞在其表面高密度培養(yǎng)與養(yǎng)分供給的微載體[3]。

殼聚糖是一種合適的生物材料，因其生物相容性和生物可降解性廣泛應(yīng)用于制備微球[4]。此外殼聚糖和 多糖（GAGs）具有相似的結(jié)構(gòu)，而 多糖恰好是細(xì)胞外基質(zhì)成分，這也是應(yīng)用殼聚糖的另外一個(gè)原因[5]。

大豆蛋白在大豆中的含量高達(dá)60%到70%[6]。更重要的是，動(dòng)物類蛋白可能會(huì)包含一些未知疾病源，而大豆蛋白可以恰好避免這一缺陷[7]。這意味著大豆蛋白來(lái)源廣、價(jià)格低，且安全性較高，將是一種可以應(yīng)用于微載體制備的新材料。在本研究中，采用殼聚糖和提取自大都的蛋白作為原材料，應(yīng)用乳化交聯(lián)法，制備微載體，并設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝。

黏

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2、實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

殼聚糖（分子量1.21.2×106）購(gòu)買自中慶化工，明膠（分子量1.4×104）購(gòu)買自光復(fù)化工。雄性Wister大鼠購(gòu)買自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其他化學(xué)試劑均為分析純。

2.2 大豆蛋白提取和檢測(cè)

將大豆浸泡于10倍蒸餾水中24小時(shí)，粉碎，滴加0.1mol/ mL氫氧化鈉溶液，使pH保持在9，并控制溫度處于25℃，過(guò)夜后放入離心機(jī)除去雜質(zhì)。上清液滴加0.1mol/mL的鹽酸溶液，使pH為4.5，常溫下靜置2h。然后離心除去上清液，蒸餾水洗滌后冷凍干燥機(jī)干燥得到提取蛋白。運(yùn)用比色法檢測(cè)所提取的大豆蛋白的性質(zhì)與含量。

2.3 微載體制備與工藝優(yōu)化

將殼聚糖和提取的蛋白溶解于1%醋酸溶液中，加入一定比例的甲苯和四氯化碳作為乳化劑，反應(yīng)2小時(shí)候加入一定比例乳化劑斯班80，之后在390轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度下持續(xù)攪拌2h，保持溫度一直處于40℃，最終得到乳化液中的微載體。將整個(gè)液體抽濾，并用蒸餾水洗滌，烘干后得到含大豆蛋白的殼聚糖微載體。之后利用響應(yīng)面分析軟件得到工藝優(yōu)化的范圍值。

2.4 微載體表征

上皮細(xì)胞培養(yǎng)與分離方法參考Mazumder等的文章描述[8]分別將微載體與上皮細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)12，24，36h，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 蛋白提取

提取的大豆蛋白粉如圖1-1所示，為白色至淡棕色外觀不規(guī)則的白色粉末，顯色法實(shí)驗(yàn)表明，蛋白粉末與考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)顯藍(lán)色。這些結(jié)果表明，提取所得的為大豆蛋白。光鏡下微載體形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1-2所示，含大豆蛋白微載體呈粒徑均一的球形。電鏡下微載體特征如圖1-3和1-4所示。

圖1.提取自大豆的蛋白粉及微載體表征

3.2 工藝優(yōu)化結(jié)果分析

響應(yīng)面曲線方差分析結(jié)果如表1所示。以微載體孔隙率作為參照標(biāo)準(zhǔn)，建立模型，模型的F值是15.2，且具有顯著性差異。表明模型可以說(shuō)明微載體工藝優(yōu)化中各參數(shù)對(duì)微載體孔隙率的影響程度。圖2-1是本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的散點(diǎn)分布圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)集中于對(duì)角線上，這表明所建立的模型方程可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖2-2、圖2-3和圖2-4顯示了孔隙度受其他三個(gè)因素的影響。這三個(gè)數(shù)據(jù)的趨勢(shì)表明，甲苯和四氯化碳比例對(duì)微球孔隙度的影響并不顯著。影響比較顯著的是殼聚糖與大豆蛋白的比例和交聯(lián)劑用量。圖2也表明，殼聚糖與大豆蛋白比例的最佳范圍是3:2到2:1，交聯(lián)劑的最佳范圍從5.2到5.8毫升，甲苯與四氯化碳比例是1:3。在這些條件下,可以獲得親和性較好的、孔隙度為80.14%的大豆蛋白-殼聚糖微載體。

圖2. 微載體制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析（圖2-1為散點(diǎn)分布圖，圖2-2，2-3，2-4分別為殼聚糖與大豆蛋白比例，乳化劑用量和交聯(lián)劑用量響應(yīng)面曲線圖）

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，大豆蛋白-殼聚糖微載體與細(xì)胞具有良好的親和性，在12，24，36h后觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞明顯貼附微載體生長(zhǎng)。

圖3. 蛋白質(zhì)-殼聚糖微載體細(xì)胞培養(yǎng)圖（a1、b1、c1、d1分別為培養(yǎng)0、12、24、36h后細(xì)胞生長(zhǎng)情況）

4、結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明，大豆蛋白-殼聚糖微載體表現(xiàn)出作為上皮細(xì)胞載體的極大潛力。添加了大豆蛋白的微載在粒徑、孔隙度、抗壓性能、密度和形狀上都顯示了較好的性能。這可以有效地降低生產(chǎn)成本?？傊?大豆蛋白-殼聚糖微載體在細(xì)胞培養(yǎng)載體方面具有較高的意義。