王歆睿 姜 薇

(遼寧省分析科學(xué)研究院 遼寧 沈陽(yáng))

食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法比較

王歆睿 姜 薇

(遼寧省分析科學(xué)研究院 遼寧 沈陽(yáng))

本文運(yùn)用國(guó)標(biāo)微生物培養(yǎng)方法和PCR法對(duì)多個(gè)人工污染食品樣本進(jìn)行檢測(cè)，從準(zhǔn)確性、靈敏度、檢測(cè)成本和檢測(cè)周期幾方面對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行比較。PCR技術(shù)具有敏感高、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)成本高，不適合大批樣品的檢測(cè)。

沙門(mén)氏菌 檢測(cè) PCR 食品

前言

沙門(mén)氏菌屬是腸桿菌科中最重要的一個(gè)屬[1]。它是引起人類(lèi)沙門(mén)氏菌食物中毒的主要致病菌[2]，引起急性胃腸炎和傷寒等烈性傳染病，對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，國(guó)家不斷加強(qiáng)對(duì)食品中致病菌的監(jiān)管，因此對(duì)食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)技術(shù)的研究十分關(guān)鍵。沙門(mén)氏菌的檢測(cè)一般有傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)，免疫學(xué)技術(shù)和PCR檢測(cè)技術(shù)三個(gè)方法[3]。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)是將樣本經(jīng)過(guò)預(yù)增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定血清學(xué)鑒定與分群四個(gè)步驟，做出鑒定。一般需要4~7天，才能得出明確的結(jié)果[4]。PCR法檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌是利用游離的脫氧核糖核苷酸（dNTP），以目標(biāo)基因組DNA上正、反相兩引物間的某一區(qū)段為模板進(jìn)行快速擴(kuò)增，電泳觀(guān)察結(jié)果[5]，可以在12小時(shí)內(nèi)快速檢測(cè)沙門(mén)菌。本文分別用國(guó)標(biāo)方法和PCR方法對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，從準(zhǔn)確性和靈敏度兩方面對(duì)這兩種檢測(cè)方法進(jìn)行比較。

1、材料和方法

1.1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

雞蛋15份，各養(yǎng)雞場(chǎng)送檢；配合飼料10份，飼料公司送檢；牛奶 8份，購(gòu)于超市。

1.1.2

沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

1.1.3 試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）實(shí)驗(yàn)室自制；四硫磺酸鈉黃綠（TTB）增菌液，亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液；亞硫酸鉍（BS）瓊脂，沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基，沙門(mén)氏菌生化鑒定盒，沙門(mén)氏菌O和H診斷血清，均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。沙門(mén)氏菌核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于北京索奧生物技術(shù)有限公司。引物：引物序列為P1:5’-CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG-3’,P2:5’-AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC-3’。

1.2 儀器設(shè)備

ABI 2720型 PCR儀、全自動(dòng)高壓滅菌器、Dynamica DNA master核酸蛋白分析儀、恒溫培養(yǎng)箱、WEALTEC凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 國(guó)標(biāo)微生物培養(yǎng)方法

1.3.1 沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后制成菌懸液,菌懸液濃度1.0×104 CFU/mL，依次稀釋菌懸液濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0 CFU/mL。吸取各濃度菌懸液1mL污染樣品。

1.3.2 前增菌：稱(chēng)取樣品25g放入無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225mL緩沖蛋白胨水（BPW）用均質(zhì)器拍打50秒，置于培養(yǎng)箱內(nèi)36℃培養(yǎng)18小時(shí)。

1.3.3 增菌 移取1mL前增菌液，分別接種于10mL四硫磺酸鈉黃綠（TTB）增菌液和10mL亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液內(nèi)，分別置于不同培養(yǎng)箱中42℃（TTB）36℃（SC）培養(yǎng)24小時(shí)。

1.3.4 分離培養(yǎng)：分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線(xiàn)接種于沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基。

36℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀(guān)察平板上菌落生長(zhǎng)情況。在沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基平板上典型沙門(mén)氏可疑菌落呈現(xiàn)光滑、略凸起，直徑1~3mm，邊緣整齊的品紅菌落。

1.3.5 生化鑒定：將可疑菌落用0.85%無(wú)菌生理鹽水稀釋至109 CFU /mL,吸取一到兩滴菌懸液接種到各西林瓶?jī)?nèi)，在培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀(guān)察反應(yīng)情況。

1.3.7 血清型鑒定 按照沙門(mén)氏菌診斷血清操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)。A-F型多價(jià)血清菌體試驗(yàn)結(jié)果分類(lèi)：陽(yáng)性反應(yīng)，混合物試驗(yàn)?zāi)?，而在鹽水對(duì)照中不凝集。陰性反應(yīng), 混合物試驗(yàn)不凝集，而在鹽水對(duì)照中也不凝集。

1.4 PCR檢測(cè)方法

1.4.1 樣品DNA的提?。簩⒃鼍河?2000r/min離心3min，收集沙門(mén)氏菌菌體，倒去上清液，滅菌生理鹽水洗滌2次，用滅菌去離子水懸浮，隔水煮沸15min，12000r/min離心3min，取上清液作為DNA模板溶液。

1.4.2 PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系（25μ L）含10×PCR Taq酶緩沖液2.5μ L，引物（10ol/L）1μ L，dNTP（2.5 mmol/L）1μ L，MgCl2（25 mmol/L）1.5μ L，Taq DNA合酶（1 U/μ L，）1μ L，DNA模板5μ L，滅菌雙蒸水13μ L。

PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；接著作35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變

性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。

1.4.3 電泳檢測(cè)：取5μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μ L上樣緩沖液混勻，分別點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝的點(diǎn)樣孔中，以100bp DNALadder為分子量標(biāo)準(zhǔn)，70 V電壓電泳1 h，經(jīng)EB染色后，用凝膠成像儀成像并觀(guān)察結(jié)果。

2、結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測(cè)結(jié)果

共33份樣品，用濃度為10.0CFU/mL沙門(mén)氏標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液人工污染樣品，分別用微生物培養(yǎng)和PCR法檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表1 人工污染菌樣品微生物培養(yǎng)和PCR檢測(cè)結(jié)果（菌液濃度10.0 CFU/mL）

微生物培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出率為100%，PCR法樣品的陽(yáng)性檢出率也可以達(dá)到100%。

經(jīng)人工污染的5份無(wú)菌牛奶樣品，菌懸液濃度分別為0、1.0、2.0、5.0、10.0 CFU/mL，國(guó)標(biāo)微生物培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果，菌懸液濃度1.0 CFU/mL的污染樣品結(jié)果為陰性，其他濃度為陽(yáng)性。PCR法檢測(cè)結(jié)果，5份污染樣品均為陽(yáng)性。

3、討論

對(duì)人工污染的33份雞蛋、飼料和牛奶樣品，分別用國(guó)標(biāo)微生物培養(yǎng)法和PCR法檢測(cè)沙門(mén)氏菌，陽(yáng)性檢出率均達(dá)到100 %，說(shuō)明這兩種方法檢測(cè)的準(zhǔn)確度都較高。國(guó)標(biāo)微生物培養(yǎng)法樣品中活菌的檢測(cè)限為2.0CFU/25g，PCR法樣品中活菌的檢測(cè)限為1.0 CFU/25g，PCR法與國(guó)標(biāo)微生物培養(yǎng)法比較具有更高靈敏度。

檢測(cè)周期上，國(guó)標(biāo)微生物培養(yǎng)法中微生物生長(zhǎng)需要時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)周期最短也需要4天時(shí)間。PCR法只需前增菌、DNA提取和電泳分離，2天時(shí)間可以出檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于急性中毒食物的檢測(cè)和新鮮即食的食品如蔬菜沙拉等可以快速檢測(cè)出結(jié)果。

[1] 碩士論文《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2009年 豬肉中沙門(mén)氏菌的分離鑒定及PCR快速檢測(cè) 楊永恒

[2] 《畜禽業(yè)》 2010年10期 自由市場(chǎng)鮮雞蛋黃中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)韓磊 趙從凱王洪波 丁雪珍 房師梅

[3] .動(dòng)物性飼料中沙門(mén)氏菌的分離鑒定與分析《中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)》 2009年S1期

[4] 《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2008年 影響食品安全的食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)與風(fēng)險(xiǎn)分析研究

[5] 《內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》 2008年03期 動(dòng)物性食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展