王歆睿 姜 薇

(遼寧省分析科學(xué)研究院 遼寧 沈陽)

食品中沙門氏菌檢測方法比較

王歆睿 姜 薇

(遼寧省分析科學(xué)研究院 遼寧 沈陽)

本文運(yùn)用國標(biāo)微生物培養(yǎng)方法和PCR法對多個(gè)人工污染食品樣本進(jìn)行檢測，從準(zhǔn)確性、靈敏度、檢測成本和檢測周期幾方面對檢測方法進(jìn)行比較。PCR技術(shù)具有敏感高、檢測周期短等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)PCR技術(shù)檢測成本高，不適合大批樣品的檢測。

沙門氏菌 檢測 PCR 食品

前言

沙門氏菌屬是腸桿菌科中最重要的一個(gè)屬[1]。它是引起人類沙門氏菌食物中毒的主要致病菌[2]，引起急性胃腸炎和傷寒等烈性傳染病，對食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，國家不斷加強(qiáng)對食品中致病菌的監(jiān)管，因此對食品中沙門氏菌檢測技術(shù)的研究十分關(guān)鍵。沙門氏菌的檢測一般有傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)，免疫學(xué)技術(shù)和PCR檢測技術(shù)三個(gè)方法[3]。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)是將樣本經(jīng)過預(yù)增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定血清學(xué)鑒定與分群四個(gè)步驟，做出鑒定。一般需要4~7天，才能得出明確的結(jié)果[4]。PCR法檢測食品中沙門氏菌是利用游離的脫氧核糖核苷酸（dNTP），以目標(biāo)基因組DNA上正、反相兩引物間的某一區(qū)段為模板進(jìn)行快速擴(kuò)增，電泳觀察結(jié)果[5]，可以在12小時(shí)內(nèi)快速檢測沙門菌。本文分別用國標(biāo)方法和PCR方法對多個(gè)樣本進(jìn)行檢測，從準(zhǔn)確性和靈敏度兩方面對這兩種檢測方法進(jìn)行比較。

1、材料和方法

1.1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

雞蛋15份，各養(yǎng)雞場送檢；配合飼料10份，飼料公司送檢；牛奶 8份，購于超市。

1.1.2

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

1.1.3 試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）實(shí)驗(yàn)室自制；四硫磺酸鈉黃綠（TTB）增菌液，亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液；亞硫酸鉍（BS）瓊脂，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，沙門氏菌生化鑒定盒，沙門氏菌O和H診斷血清，均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。沙門氏菌核酸擴(kuò)增檢測試劑盒，購于北京索奧生物技術(shù)有限公司。引物：引物序列為P1:5’-CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG-3’,P2:5’-AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC-3’。

1.2 儀器設(shè)備

ABI 2720型 PCR儀、全自動(dòng)高壓滅菌器、Dynamica DNA master核酸蛋白分析儀、恒溫培養(yǎng)箱、WEALTEC凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 國標(biāo)微生物培養(yǎng)方法

1.3.1 沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后制成菌懸液,菌懸液濃度1.0×104 CFU/mL，依次稀釋菌懸液濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0 CFU/mL。吸取各濃度菌懸液1mL污染樣品。

1.3.2 前增菌：稱取樣品25g放入無菌均質(zhì)袋中，加入225mL緩沖蛋白胨水（BPW）用均質(zhì)器拍打50秒，置于培養(yǎng)箱內(nèi)36℃培養(yǎng)18小時(shí)。

1.3.3 增菌 移取1mL前增菌液，分別接種于10mL四硫磺酸鈉黃綠（TTB）增菌液和10mL亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液內(nèi)，分別置于不同培養(yǎng)箱中42℃（TTB）36℃（SC）培養(yǎng)24小時(shí)。

1.3.4 分離培養(yǎng)：分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基。

36℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察平板上菌落生長情況。在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上典型沙門氏可疑菌落呈現(xiàn)光滑、略凸起，直徑1~3mm，邊緣整齊的品紅菌落。

1.3.5 生化鑒定：將可疑菌落用0.85%無菌生理鹽水稀釋至109 CFU /mL,吸取一到兩滴菌懸液接種到各西林瓶內(nèi)，在培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察反應(yīng)情況。

1.3.7 血清型鑒定 按照沙門氏菌診斷血清操作說明書進(jìn)行反應(yīng)。A-F型多價(jià)血清菌體試驗(yàn)結(jié)果分類：陽性反應(yīng)，混合物試驗(yàn)?zāi)?，而在鹽水對照中不凝集。陰性反應(yīng), 混合物試驗(yàn)不凝集，而在鹽水對照中也不凝集。

1.4 PCR檢測方法

1.4.1 樣品DNA的提?。簩⒃鼍河?2000r/min離心3min，收集沙門氏菌菌體，倒去上清液，滅菌生理鹽水洗滌2次，用滅菌去離子水懸浮，隔水煮沸15min，12000r/min離心3min，取上清液作為DNA模板溶液。

1.4.2 PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系（25μ L）含10×PCR Taq酶緩沖液2.5μ L，引物（10ol/L）1μ L，dNTP（2.5 mmol/L）1μ L，MgCl2（25 mmol/L）1.5μ L，Taq DNA合酶（1 U/μ L，）1μ L，DNA模板5μ L，滅菌雙蒸水13μ L。

PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；接著作35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變

性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。

1.4.3 電泳檢測：取5μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μ L上樣緩沖液混勻，分別點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝的點(diǎn)樣孔中，以100bp DNALadder為分子量標(biāo)準(zhǔn)，70 V電壓電泳1 h，經(jīng)EB染色后，用凝膠成像儀成像并觀察結(jié)果。

2、結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果

共33份樣品，用濃度為10.0CFU/mL沙門氏標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液人工污染樣品，分別用微生物培養(yǎng)和PCR法檢測，結(jié)果如表1所示。

表1 人工污染菌樣品微生物培養(yǎng)和PCR檢測結(jié)果（菌液濃度10.0 CFU/mL）

微生物培養(yǎng)法陽性檢出率為100%，PCR法樣品的陽性檢出率也可以達(dá)到100%。

經(jīng)人工污染的5份無菌牛奶樣品，菌懸液濃度分別為0、1.0、2.0、5.0、10.0 CFU/mL，國標(biāo)微生物培養(yǎng)法檢測結(jié)果，菌懸液濃度1.0 CFU/mL的污染樣品結(jié)果為陰性，其他濃度為陽性。PCR法檢測結(jié)果，5份污染樣品均為陽性。

3、討論

對人工污染的33份雞蛋、飼料和牛奶樣品，分別用國標(biāo)微生物培養(yǎng)法和PCR法檢測沙門氏菌，陽性檢出率均達(dá)到100 %，說明這兩種方法檢測的準(zhǔn)確度都較高。國標(biāo)微生物培養(yǎng)法樣品中活菌的檢測限為2.0CFU/25g，PCR法樣品中活菌的檢測限為1.0 CFU/25g，PCR法與國標(biāo)微生物培養(yǎng)法比較具有更高靈敏度。

檢測周期上，國標(biāo)微生物培養(yǎng)法中微生物生長需要時(shí)間較長，檢測周期最短也需要4天時(shí)間。PCR法只需前增菌、DNA提取和電泳分離，2天時(shí)間可以出檢測結(jié)果，對于急性中毒食物的檢測和新鮮即食的食品如蔬菜沙拉等可以快速檢測出結(jié)果。

[1] 碩士論文《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2009年 豬肉中沙門氏菌的分離鑒定及PCR快速檢測 楊永恒

[2] 《畜禽業(yè)》 2010年10期 自由市場鮮雞蛋黃中沙門氏菌的檢測韓磊 趙從凱王洪波 丁雪珍 房師梅

[3] .動(dòng)物性飼料中沙門氏菌的分離鑒定與分析《中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)》 2009年S1期

[4] 《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2008年 影響食品安全的食源性致病菌快速檢測技術(shù)與風(fēng)險(xiǎn)分析研究

[5] 《內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》 2008年03期 動(dòng)物性食品中沙門氏菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展