劉露+李麗+閆洪雪

摘要：從黃島區(qū)鹽堿地采集土壤樣品，分離和篩選高效解磷菌，并進(jìn)行鑒定，在此基礎(chǔ)上，研究了其對(duì)鹽堿地的改良作用。結(jié)果表明，從鹽堿地中分離到6株解磷菌，其中PC02解磷能力最高，有效磷含量為80.3 mg/L；結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將其鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；解磷菌PC02具有降低鹽堿地pH值和提高土壤有效磷含量的作用。

關(guān)鍵詞：鹽堿地；解磷菌；巨大芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）11-0069-04

Abstract The soil sample of saline-alkali land in Huangdao was collected to isolate and screen high phosphate-solubilizing bacteria， then the screened strain was identified and its improving effects on saline-alkali land were determined. The results showed that six phosphate-solubilizing bacterial strains were isolated， among which， PC02 had the highest phosphate-solubilizing capacity with the available phosphorus content of 80.3 mg/L. Combined with the analyses of morphological， physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequence and phylogenetic tree， PC02 was identified as Bacillus megaterium. It had the functions of reducing pH value and improving available phosphorus content of saline-alkali land.

Keywords Saline-alkali land； Phosphate-solubilizing bacterium； Bacillus megaterium

土壤鹽堿化是一個(gè)世界性問題。據(jù)估計(jì)，全球鹽堿地每年以100萬～150萬 hm2的速度增長(zhǎng)[1]。鹽堿地占全球總陸地面積的10%[2]，我國(guó)是土壤鹽堿化最為嚴(yán)重的國(guó)家之一。鹽堿地治理是一項(xiàng)長(zhǎng)期持久的工作，最本質(zhì)的是從根本上改良鹽堿地。磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可直接影響作物產(chǎn)量。植物吸收的磷主要來自土壤，而鹽堿地中pH較高，95%以上的磷很難被植物直接吸收利用，為無效態(tài)磷[3]。另外，作物對(duì)施入的磷肥當(dāng)季利用率只有5%～10%[4]，大部分磷積累在土壤中，因此提高鹽堿地中磷的利用率具有非常重要的意義。

解磷菌是一種可將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能類群[5]，在轉(zhuǎn)化土壤難溶性磷和提高磷肥利用率方面具有非常重要的作用[6]。解磷菌成為研究熱點(diǎn)。然而對(duì)解磷菌的研究多在對(duì)一些作物生長(zhǎng)的影響上，未見對(duì)鹽堿地改良效果的相關(guān)研究。本文針對(duì)鹽堿地問題篩選并鑒定了一株高效解磷菌，并初步試驗(yàn)了其對(duì)鹽堿地的改良效果，以期為鹽堿地改良提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 土樣：采自青島黃島區(qū)鹽堿地。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，磷酸三鈣 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，酵母粉 0.5 g，水1 L，pH 7.0。

初篩培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20 g。

PVK培養(yǎng)基：初篩培養(yǎng)基加入0.4%溴酚藍(lán)（pH 6.7）6 mL。

復(fù)篩培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉 10 g，磷酸三鈣 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，水1 L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.1 g，MnSO4 0.02 g，水1 L，pH 7.0。

生理生化鑒定培養(yǎng)基：依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解磷菌的分離和篩選 取10 g采集土樣置于100 mL無菌水搖瓶中，32℃振蕩30 min；取5 mL原液加到以磷酸三鈣為唯一磷源的50 mL富集培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)72 h；取5 mL富集液轉(zhuǎn)移到另一新鮮的富集培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。

將最后的富集液稀釋105倍，取稀釋的懸液0.1 mL涂布初篩培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)。待平板長(zhǎng)出菌落，挑取單菌落，在另一個(gè)平板上劃線純化，多次劃線后用顯微鏡檢查菌落是否單一，直至獲得純培養(yǎng)物后斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高效解磷優(yōu)良菌株的篩選 將篩選到的菌株接種到PVK培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)48 h，觀察透明圈大小。選擇透明圈較大的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

按照文獻(xiàn)[8]檢測(cè)有效磷含量。將篩選到的菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)4 d，12 000 r/min離心10 min，取上清液按照文獻(xiàn)方法檢測(cè)有效磷含量。

1.2.3 高效解磷優(yōu)良菌株的鑒定 ① 形態(tài)學(xué)特征與生理生化特征鑒定。將篩選到的高效解磷優(yōu)良菌株涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，32℃培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞形態(tài)和菌落特征，部分生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]。

② 16S rDNA鑒定?；蚪M總DNA提取后，利用正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′進(jìn)行16S rDNA全序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增效果。將克隆后的樣品送至華大基因進(jìn)行測(cè)序。

將所得序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，并選取相關(guān)菌株，利用MEGA 5.0軟件采用Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 高效解磷優(yōu)良菌株的解磷特性研究 將篩選到的高效解磷優(yōu)良菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至完全轉(zhuǎn)芽孢。以黃島區(qū)鹽堿地為試驗(yàn)對(duì)象，將該菌株發(fā)酵液施入鹽堿地，以不施發(fā)酵液的鹽堿地為對(duì)照，比較pH值、有效磷含量。pH值測(cè)定采用電位測(cè)定法，有效磷含量測(cè)定同1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效解磷菌株的分離篩選

本研究從黃島區(qū)鹽堿地中通過富集和初篩分離到18株細(xì)菌，在PVK培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、可產(chǎn)生透明圈的有6株，編號(hào)分別為PA03、PB01、PB03、PC02、PC05和PF03。這6株菌能在以磷酸三鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并能在PVK培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈，說明這6株菌具有解磷效果。

將篩選到的6株細(xì)菌接種到復(fù)篩培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)4 d，所得上清液的有效磷含量如表1所示?？梢?，菌株P(guān)C02發(fā)酵液內(nèi)有效磷含量明顯高于其他菌株，因此將其作為下一步的研究菌株。

2.2 高效解磷菌株P(guān)C02的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 菌株P(guān)C02在初篩平板上培養(yǎng)48 h后，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，隆起，濕潤(rùn)，邊緣整齊；桿狀，有芽孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。

2.2.2 生理生化特性 菌株P(guān)C02的生理生化結(jié)果如表2所示?？梢?，該菌株與巨大芽孢桿菌的生理生化特征相同，結(jié)合形態(tài)特征，該菌株初步鑒定為巨大芽孢桿菌。

2.2.3 16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 測(cè)序得到菌株P(guān)C02的16S rDNA基因序列，1 404 bp。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示，菌株P(guān)C02與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）親緣關(guān)系最近，確定該菌株為巨大芽孢桿菌。

2.3 高效解磷菌株P(guān)C02發(fā)酵液對(duì)鹽堿地的改良作用

在PC02發(fā)酵液施入鹽堿地前，對(duì)照組和試驗(yàn)組pH值均為8.12，有效磷含量為8 mg/kg，總磷含量0.12%。施入3個(gè)月后，對(duì)照組pH值、有效磷含量和總磷含量無明顯變化，試驗(yàn)組pH 值7.76，有效磷含量 11 mg/kg，總磷含量0.12%。通過施入PC02發(fā)酵液，土壤pH值明顯降低，總磷不變的情況下有效磷含量明顯提高，可見巨大芽孢桿菌對(duì)鹽堿地有一定的改良作用。

3 討論與結(jié)論

本研究從黃島區(qū)鹽堿地中分離出6株解磷菌，通過對(duì)有效磷的定量檢測(cè)，篩選到一株解磷能力強(qiáng)的菌株P(guān)C02。結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析將其鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。通過鹽堿地改良試驗(yàn)，證明了解磷菌PC02可降低土壤pH和提高土壤有效磷含量。

本研究篩選到的解磷菌PC02解磷能力較強(qiáng)，但與李鳴曉[10]、李振東[11]等篩選到的菌株解磷能力還有一定差距，可以通過菌株馴化、誘變育種或培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化來提高菌株的解磷能力。植物對(duì)有效磷的吸收利用是一個(gè)較復(fù)雜的過程，菌株轉(zhuǎn)化的有效磷對(duì)植物生長(zhǎng)的作用有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Kovda V A. Loss of productive land due to salinization[J]. Ambio.， 1983， 12（2）： 9l-93.

[2] 趙明范. 世界土壤鹽漬化現(xiàn)狀及研究趨勢(shì)[J]. 世界林業(yè)研究， 1994， 7（1）： 84-86.

[3] 邵宗臣， 趙美芝. 土壤中積累態(tài)磷活化動(dòng)力學(xué)的研究Ⅰ.有機(jī)質(zhì)的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào)， 2002， 39（3）： 318-325.

[4] 賀夢(mèng)醒， 高毅， 胡正雪， 等. 解磷菌株B25的篩選、鑒定及其解磷能力[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2012， 23 （1）： 235-239.

[5] 吳鵬飛， 張冬梅， 郝麗紅， 等. 解磷微生物研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 2008， 10 （3）： 40-46.

[6] Mehta P， Walia A， Chauhan A， et al. Plant growth promoting traits of phosphate-solubilizing rhizobacteria isolated from apple trees in trans Himalayan region of Himachal Pradesh[J]. Arch. Microbiol.， 2013， 195 （5）： 357-369.

[7] 東秀珠， 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2001： 349-388.

[8] 南京農(nóng)學(xué)院. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1980.

[9] 布坎南， 吉本斯， 等. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 科學(xué)出版社， 1984： 729-759.

[10]李鳴曉， 席北斗， 魏自民， 等. 耐高溫解磷菌的篩選及解磷能力研究[J]. 環(huán)境科學(xué)研究， 2008， 21（3）： 165-169.

[11]李振東， 陳秀蓉， 楊成德， 等. 乳白香青內(nèi)生解磷菌的篩選鑒定及解磷特性研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 22（6）：150-158.