張雪寒，張 強(qiáng)，張碧成，汪 偉，倪艷秀，溫立斌，李 彬，周俊明，何孔旺，周 萍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 / 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

?

檢測產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌抗體的間接ELISA試劑盒的研制

張雪寒，張 強(qiáng)，張碧成，汪 偉，倪艷秀，溫立斌，李 彬，周俊明，何孔旺，周 萍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 / 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

本研究旨在研制一種以緊密素為檢測靶標(biāo)的間接ELISA技術(shù)，檢測血清中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxigenicEscherichiacoli,STEC)的抗體水平。根據(jù)緊密素27個亞型的N端保守序列，體外表達(dá)390～543 aa片段制備包被抗原，通過敏感性、特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，建立檢測STEC的抗體的間接 EIISA方法。經(jīng)優(yōu)化篩選的間接ELISA最佳反應(yīng)條件：抗原包被濃度3 ng/孔，待檢血清稀釋比例1∶200，HRP-兔抗羊IgG、HRP-兔抗牛IgG的工作濃度均為1∶15000，5 %脫脂奶封閉l h，底物作用時間10 min，用于牛、羊疫苗抗體檢測或者STEC大腸桿菌感染的監(jiān)測。

致病性大腸桿菌；緊密素；間接ELISA

產(chǎn)志賀毒素性大腸桿菌(Shiga toxigenicEscherichiacoli,STEC)是一個多樣的家族，其中的很多O∶H血清型與人類疾病密切相關(guān)。眾所周知，STEC O157∶H7曾在全世界范圍內(nèi)引發(fā)大范圍的感染發(fā)病[1]，導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件爆發(fā)。中國自1986年[2]首次報(bào)告O157∶H7感染的病例以來，已先后有江蘇、山東、河南、安徽、北京等十幾個省市發(fā)現(xiàn)O157∶H7感染的散發(fā)病例，潛在著疫情爆發(fā)流行的威脅，僅在1999年江蘇省徐州局部地區(qū)短期內(nèi)就報(bào)告了131例O157感染性腹瀉病例，其中僅有16例治愈，115例因并發(fā)急性腎衰而死亡[3-4]。非O157∶H7引發(fā)的公共衛(wèi)生事件逐漸凸顯[5]，2012年因美國感染STEC而發(fā)病病例231,157中，59.7 %為非O157∶H7血清型感染，40.3 %為O157∶H7感染[6]。美國1983-2002年度期間，O26、O45、O103、O111、O121和O145血清型感染導(dǎo)致的人群發(fā)病占非O157∶H7致病總?cè)藬?shù)的75 %[7]。

緊密素是STEC非常重要的毒力因子，功能研究最為清楚，主導(dǎo)菌體在宿主腸上皮細(xì)胞的定植，促進(jìn)肌動蛋白聚合和基座樣結(jié)構(gòu)形成，造成嚴(yán)重的腸絨毛脫落，即attaching/effacing(A/E)損傷。Intimin編碼基因eae，有27個亞型α1、α2、β1、β2、β3、ε1、ε2、ε3、ε4、η1、η2、θ、λ、μ、ν、ξ1、ξ3、ο、π、ρ、σ、τ1、τ2、б、γ1、γ2和κ，與菌株血清型和致病性關(guān)系密切[8-9]。大部分STEC O157∶H7 和O145攜帶有eae-γ亞型，也有少數(shù)O157∶H7攜帶有eae-α亞型。大部分O26和O121攜帶有eae-β，大部分O103主要攜帶有eae-ε、大部分O45 和O111主要攜帶eae-θ亞型[10-11]。

當(dāng)前，沒有國家批準(zhǔn)和市售的STEC的抗體檢測技術(shù)?？焖?、特異，適合批量檢測的方法將為食源性致病性大腸桿菌的防控提供技術(shù)保障。隨著抗生素的泛濫使用、導(dǎo)致菌株毒力基因更多變異，加之人類飲食結(jié)構(gòu)的改變，更加重視食物營養(yǎng)的保留，食物被致病性大腸桿菌污染的幾率增高、人類感染的機(jī)會也會隨之更頻繁。有效控制食物鏈中的動物的感染和帶菌，將會大大減少對人類的危害。ELISA方法檢測流程成熟、易于掌握，不需要高值儀器，更適合養(yǎng)殖場、疾病控制中心以及進(jìn)出口檢疫機(jī)構(gòu)規(guī)模量樣品的檢測以及流行病學(xué)分析。因此，本研究旨在擴(kuò)增緊密素保守區(qū)域，體外表達(dá)重組抗原，建立STEC的ELISA檢測技術(shù)，組裝試劑盒，便于推廣和使用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

ExTaqDNA聚合酶(5 U/μl)、dNTPs(TaKaRa公司)、BamHI 和HindIII 限制性內(nèi)切酶；Dynabeads anti-E.coliO157免疫磁珠(北京天為公司)；LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、TMB顯色液(南京助研生物公司)；HRP-葡萄球菌A蛋白、HRP-兔抗羊IgG、HRP-兔抗牛IgG(美國KPL公司)、HRP-羊抗小鼠IgG，HRP-羊抗豬IgG和HRP-小鼠抗人IgG(武漢博士德公司)。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

利用計(jì)算機(jī)軟件DNAStar對STEC eae基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。緊密素基因序列號分別為eae-α (accession no. M58154)、eae-α2 (AF530555)、 eae-β (AF453441)、eae-β2 (AJ715407)、 eae-β3 (AJ876651)、 eae-γ(Z11541)、eae-γ2 (AF025311)、 eae-δ (AJ875027)、eae-ε (AF116899)、 eae-ε2 (AF530554)、 eae-ε3 (AJ876650)、eae-ε4 (AJ876651)、 eae-ζ (AF449417)、eae-η (AJ308550)、 eae-η2 (AJ876652)、 eae-θ(AF449419)、eae-ι (AJ308551)、 eae-ι2 (AF530553)、eae-κ (U66102)、 eae-λ (AF530557)、 eae-μ (AJ705049)、eae-ν (AJ705050)、 eae-ξ (AJ705051)、 eae-ο (AJ584841, partial)、eae-π (AJ705052)、 eae-ρ (AJ748082) 和eae-σ (AJ781125)。全長27個亞型的eae基因在氨基酸和核苷酸水平的同源性分別介于68.6 %～99.9 %和77.4 %～100 %，圖1。保守區(qū)域的篩選和引物的設(shè)計(jì)主要通過計(jì)算機(jī)軟件DNAStar和Primer Premier 5對整個eae基因進(jìn)行比對分析，N端1171～1629核苷酸保守性好，且氨基酸抗原性良好。故以1171～1629核苷酸459 nt區(qū)域設(shè)計(jì)引物eae-F和eae-R。其中eae-F的N端含有3個保護(hù)性堿基(TAA)和1個限制性酶切位點(diǎn)BamH I(GGATCC)；eae-R的N端含有3個保護(hù)性堿基(GGG)和1個限制性酶切位點(diǎn)HindIII(AAGCTT)。引物序列如下：eae-F：5-TAAGGATCCtaccgtcatggtacgggt-3，eae-R：5-GGGAAGCTTctgtacattgttagagct-3。

圖1 大腸桿菌eae基因氨基酸水平的同源性分析Fig.1 Identical analysis of amino acids encoded by E. coli eae gene

1.3 重組蛋白表達(dá)、純化和Western blotting檢測

常規(guī)PCR方法擴(kuò)增eae目的片段459 bp，克隆到低溫表達(dá)載體 pCold I質(zhì)粒中，成功構(gòu)建重組菌BL21(pCold I-eae)。重組菌培養(yǎng)物中加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)，收集菌液，超聲裂解，收集上清進(jìn)行SDS-PAGE(圖2)。重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，STEC O157∶H7血清為一抗， HRP-兔抗牛的IgG為二抗，DAB顯色液顯色，觀察是否有預(yù)期目的條帶出現(xiàn)。

1.4 間接ELISA方法的建立

1.4.1 重組蛋白抗原最適包被濃度及待檢血清稀釋濃度的確定 包被液將純化的重組蛋白62.50、31.25、15.63、7.81、3.91和1.95 ng/mL分別包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜。用PBS將牛源大腸桿菌O157∶H7陽性血清以及陰性血清分別進(jìn)行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍比稀釋，組成方陣。將包被好的酶標(biāo)板用洗板機(jī)將包被液吸出，PBST洗滌3次，加入5 %明膠封閉液，300 μl/孔，37 ℃濕盒內(nèi)孵育2 h。封閉后，同上洗滌，分別加入倍比稀釋的大腸桿菌陰陽性血清，100 μl/孔，37 ℃濕盒內(nèi)孵育1 h，洗滌后，按照方陣加入稀釋好的HRP-兔抗牛IgG(1∶15000)，100 μl/孔，洗滌后，加入底物100 μl/孔，室溫顯色10 min，加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀讀出陽性血清OD450值在1.0左右，且陰性值低，P/N值高的抗原濃度和血清工作濃度，從而確定抗原最適包被濃度和血清稀釋度。

1.4.2 重組抗原包被條件的確定 以最適抗原濃度包被酶標(biāo)板，100 μl/孔，分成4組。I 組，37 ℃包被2 h；II 組，37 ℃包被3 h；III 組，37 ℃包被1 h加4 ℃過夜；IV 組，4 ℃過夜。將包被好的酶標(biāo)板洗滌，37 ℃濕盒內(nèi)封閉2 h，封閉后每孔加入最適的血清稀釋度，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h。洗滌后，每孔加入1∶15000稀釋的HRP-兔抗牛IgG，100 μl /孔，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h。洗滌后，加入底物100 μl /孔，室溫顯色10 min，加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀的OD450值，比較陰陽性血清OD450值且陰性值低，P/N值高的抗原包被時間，以確定最佳的包被條件。

1.4.3 封閉液以及封閉時間的確定 以最適的抗原濃度和最佳抗原包被條件包被酶標(biāo)板，洗滌后，分成4組。I 組，5 %脫脂奶粉；II 組，5 %小牛血清；III 組，5 % BSA(牛血清白蛋白)；IV 組，5 %明膠。濕盒內(nèi)封閉時間分別為1.0、1.5、2.0和2.5 h，每個組分別作3個平行孔。封閉后洗滌，加入最適濃度的陰陽性血清，100 μl /孔，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h，洗滌后加入1∶15000稀釋的HRP-兔抗牛IgG，100 μL /孔，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h。洗滌后，加入底物100 μl /孔，室溫顯色10 min，加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀的OD450值，以確定最佳的封閉液種類和封閉時間。

1.4.4 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)和作用時間的確定 以最適的抗原濃度和最佳抗原包被條件包被酶標(biāo)板，洗滌后，加入5 %明膠封閉液，37 ℃濕盒內(nèi)封閉2 h。封閉后，洗滌同上，加入最適陰陽性血清濃度，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h。HRP-兔抗牛IgG按照1∶10000、1∶15000、1∶20000、1∶25000和1∶30000稀釋，每個稀釋度作3個平行，作用時間分別為30、60、90和120 min。洗滌后，加入底物100 μl /孔，室溫顯色10 min，加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀的OD450值，以確定最佳的二抗稀釋度和作用時間。

1.4.5 血清最佳作用時間的確定 以最適抗原濃度和最佳抗原包被條件包被酶標(biāo)板，分成4組。將包被好的酶標(biāo)板洗滌，37 ℃濕盒內(nèi)封閉2 h，封閉后每孔加入最適的血清稀釋度，37 ℃濕盒內(nèi)作用30、60、90和120 min。洗滌后，1∶15000稀釋的HRP-兔抗牛IgG，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h，洗滌后每孔加入新鮮的底物溶液，室溫顯色10 min，加入2M H2SO4終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀的OD450值，以確定待檢血清合適的作用時間。

1.4.6 底物反應(yīng)時間的確定 以最適抗原濃度和最佳抗原包被條件包被酶標(biāo)板，分成4組。將包被好的酶標(biāo)板洗滌，37 ℃濕盒內(nèi)封閉2 h，封閉后每孔加入最適的血清稀釋度，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h。洗滌后，1∶15000稀釋的HRP-兔抗牛IgG，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h，洗滌后每孔加入底物溶液，室溫條件下顯色時間分別為5、10、15和20 min，加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀的OD450值，以確定最佳底物顯色時間。

1.4.7 不同種屬酶標(biāo)IgG的比較 以最適的抗原濃度和最佳抗原包被條件包被酶標(biāo)板，洗滌后，加入5 %明膠封閉液，37 ℃濕盒內(nèi)封閉2 h。封閉后，洗滌同上，加入相應(yīng)種屬陰陽性血清濃度，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h。HRP-兔抗牛IgG、HRP-兔抗羊IgG、HRP-羊抗小鼠IgG、HRP-羊抗豬IgG和HRP-SPA按照1∶15000稀釋，每個酶標(biāo)抗體作2個平行，作用時間為60 min。洗滌后，加入底物100 μl /孔，室溫顯色10 min，加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀的OD450值，以明確HRP-SPA是否可以用于檢測多物種的IgG。

1.4.8 特異性交叉試驗(yàn) 用純化好的重組蛋白在最適包被條件下包被酶標(biāo)板，洗滌封閉后，分別將小鼠沙門氏桿菌、小鼠單增李斯特氏桿菌、小鼠彎曲桿菌、豬鏈球菌、豬巴氏桿菌和小鼠非致病性大腸桿菌K12的陽性血清作1∶40稀釋，同時設(shè)置緊密素抗體陽性血清對照和陰性血清對照，100 μl /孔，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h，洗滌后，加入1∶15000稀釋的相應(yīng)的種屬二抗，37 ℃濕盒內(nèi)作用1 h，洗滌后每孔加入底物顯色10 min，終止液終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀上的OD450值，進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4.9 陰陽性臨界值 利用本發(fā)明建立的ELISA檢測方法對28份牛陰性血清樣品，方法參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行檢測，以STEC O157∶H7抗體陽性血清為參照計(jì)算P/N值，對這些血清型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

1.5.1 批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn) 使用同批誘導(dǎo)純化制備的Intimin重組蛋白，按最佳抗原包被濃度包被酶標(biāo)板，用已建立的ELISA操作方法，在不同時間分別檢測8份隨機(jī)選擇的STEC O157∶H7抗體水平不同的血清與標(biāo)準(zhǔn)血清，用酶標(biāo)儀儀在450 nm波長下測定OD值。計(jì)算各份血清S/P值，以及S/P值的平均值X，標(biāo)準(zhǔn)差SD，變異系數(shù)c.v.。

1.5.2 批間重復(fù)實(shí)驗(yàn) 使用不同批次誘導(dǎo)純化制備的Intimin重組蛋白，按最佳抗原包被濃度包被酶標(biāo)板，用已建立的ELISA操作方法，同時檢測8份隨機(jī)選擇的ETEC抗體水平不同的血清，用酶標(biāo)儀儀在450nm波長下測定OD值。計(jì)算各份血清S/P值，以及S/P值的平均值X，標(biāo)準(zhǔn)差SD，變異系數(shù)c.v.。

1.6 ELISA方法檢測免疫動物的抗體滴度

1.6.1 免疫?？贵w檢測 選擇2月齡犢牛，頸部皮下注射 STEC O157∶H7亞單位疫苗(H7-HCP-Tir-Intimin)[13]，分別于免疫前、免疫后7、14、21、28和35 d采集血清測定intimin抗體滴度。ELISA操作步驟如下：純化的intimin包被酶標(biāo)板，工作濃度為3 ng/孔，抗原包被條件為37 ℃ 包被1 h加4 ℃過夜；血清稀釋度和反應(yīng)時間為1∶40和1 h；使用5 %的明膠封閉，封閉時間均為2 h；HRP-兔抗牛IgG的使用濃度和反應(yīng)時間為1∶15000 和1 h；常溫下，底物反應(yīng)時間為10 min。加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀的OD450。結(jié)果顯示：免疫后，P/N值大于2.1(免疫后血清OD450/免疫前血清OD450)，表明intimin間接ELISA方法可以檢測疫苗免疫后抗體水平的消長趨勢。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1～2：誘導(dǎo)后重組菌BL21(pCold I-eae)；3～4：誘導(dǎo)前重組菌BL21(pCold I-eae)圖2 重組蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS -PAGE analysis of the recombinant protein

1.6.2 山羊抗體檢測 選擇2月齡，勁部皮下多點(diǎn)注射STEC O103菌株滅活疫苗分別于免疫前、免疫后14 d、和二免后14和28 d采集血清測定intimin抗體滴度。ELISA操作步驟如下：純化的intimin包被酶標(biāo)板，工作濃度為3 ng/孔，抗原包被條件為37 ℃ 包被1 h加4 ℃過夜；血清稀釋度和反應(yīng)時間為1∶40和1 h；使用5 %的明膠封閉，封閉時間均為2 h；HRP-兔抗羊IgG的使用濃度和反應(yīng)時間為1∶15000 和1 h；常溫下，底物反應(yīng)時間為10 min。加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，記錄酶標(biāo)儀的OD450。結(jié)果顯示：免疫后，P/N值大于2.1(免疫后血清OD450/免疫前血清OD450)，表明intimin間接ELISA方法可以檢測疫苗免疫后抗體水平的消長趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白表達(dá)和Western blotting鑒定

重組菌BL21(pCold I-eae)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，目的蛋白獲得高效表達(dá)，分子量大小為16 kD(圖2)。菌體超聲波破碎的上清和沉淀SDS-PAGE顯示，目的蛋白存在菌體破碎上清中，而重組菌誘導(dǎo)前則無相應(yīng)的蛋白條帶出現(xiàn)。Western blot 試驗(yàn)顯示，重組His-intimin蛋白能夠與STEC O157∶H7 全菌上清反應(yīng)，呈現(xiàn)條帶單一的反應(yīng)帶(圖3)。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1：重組蛋白圖3 重組蛋白的Western blot 分析Fig.3 Western blot analysis of the recombinant protein

血清稀釋倍數(shù)Serumdilutiontimes抗原稀釋倍數(shù)Antigendilutiontimes1∶1001∶2001∶4001∶8001∶16001∶32001∶101.3561.1050.9940.7830.680.6970.3640.3060.290.310.2750.3081∶201.2510.9270.7640.6390.6150.6940.2270.2230.2120.1570.1160.1091∶401.3811.0810.8670.7450.6930.720.2580.2010.2120.1350.1130.0991∶801.2670.990.8440.7310.6780.6740.1050.1040.09550.09130.09050.077

2.2 間接ELISA 方法的建立

2.2.1 最適抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 重組蛋白包被抗原濃度為0.031 μg/mL，血清l∶40稀釋時的P/N 值(5.3) 最大，陽性血清OD450nm>1，陰性血清OD450nm< 0.25。 因此，確定抗原的最適包被濃度為3 ng/孔，血清最佳稀釋度為1∶40(表1)。

2.2.2 抗原包被條件、封閉條件和酶標(biāo)IgG的工作條件優(yōu)化 最佳抗原包被條件37 ℃包被1 h加4 ℃過夜；最佳封閉條件37 ℃ 5 %明膠封閉1 h；最佳 HRP-兔抗牛IgG最佳工作濃度1∶15000，37 ℃孵育1 h。

2.2.3 顯色時間優(yōu)化 比較顯色5、10、15 min 后的P/N值，以底物作用10 min 時的P/N值最大，且時間長短易于控制，確定底物最佳反應(yīng)時間為10 min。

2.2.4 不同種屬酶標(biāo)二抗的比較 HRP-SPA替代HRP-羊抗小鼠IgG和HRP-羊抗豬IgG時，OD450變化不明顯，而替代HRP-兔抗牛IgG、HRP-兔抗羊IgG時，OD450差異較大。因此，HRP-SPA可以用來檢測小鼠和豬血清，而牛和羊血清需要使用對應(yīng)種屬的酶標(biāo)IgG進(jìn)行檢測。

2.2.5 陰陽性臨界值確定 28份血清OD450平均值 (0.127)和標(biāo)準(zhǔn)差S(0.039)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，OD450≥+3S=0.244時，判為陽性；OD450≤+2S=0.205時，判為陰性；介于二者之間判為可疑。

為消除每次間接ELISA 檢測時，實(shí)驗(yàn)環(huán)境及操作的影響，每次檢測時加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，通過計(jì)算各份血清OD450與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD450的比值S/P，來進(jìn)行陰陽性判斷。取52份來自江蘇省多地未感染未免疫牛場的犢牛血清，按已確定的條件進(jìn)行間接ELISA，測定OD450，計(jì)算血清(OD450≤0.205)與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD450的比值S/P，計(jì)算S/P 值的平均值X 及標(biāo)準(zhǔn)方差SD，陰陽性臨界值=X+3SD。經(jīng)檢測，52份中有47份血清OD450≤0.205，計(jì)算47 份血清的S/P平均值X=0.167，SD=0.051，因此ELISA 陰陽性臨界值=0.157+3×0.051=0.31。因此，當(dāng)樣品S/P 值≥ 0.31 時為陽性，S/P 值<0.31時為陰性。根據(jù)分析結(jié)果得出本發(fā)明建立的ELISA試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)。①陽性標(biāo)準(zhǔn)孔的OD450≥+3S=0.244，且P/N≥2.1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。否則需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。②如果待檢樣品S/P 值≥ 0.31 時，判定該樣品為STEC 抗體陽性。③如果待檢樣品S/P 值<0.31時，判定該樣品為STEC 抗體陰性。

2.2.6 特異性交叉試驗(yàn) 檢測已知的小鼠沙門氏桿菌、牛單增李斯特氏桿菌、牛彎曲桿菌、豬鏈球菌、豬巴氏桿菌和小鼠非致病性大腸桿菌K12的陽性血清和陰性血清分別1∶40稀釋，2個平行重復(fù)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔OD值，結(jié)果表明，小鼠沙門氏桿菌、牛單增李斯特氏桿菌、牛彎曲桿菌、豬鏈球菌、豬巴氏桿菌和小鼠非致病性大腸桿菌K12的陽性血清的OD450值介于0.01～0.33，認(rèn)定與重組intimin包被抗原無明顯交叉反應(yīng)(表2)。

2.3 重復(fù)性檢測

檢測結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，批內(nèi)重復(fù)的8份血清OD450的變異系數(shù)在0.01～0.10(表3)；批間重復(fù)的8份血清OD450的變異系數(shù)在0.01～0.06(表4)，同批和不同批抗原在不同時間操作檢測結(jié)果均重復(fù)性較好。

表2 間接ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果

表3 批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表4 批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.4 ELISA試劑盒檢測免疫動物的抗體

2.4.1 免疫?？贵w檢測 2月齡犢牛免疫后7 d 血清OD已經(jīng)轉(zhuǎn)陽，OD450=0.42，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD450=1.12，S/P=0.38>0.31，隨著免疫天數(shù)延長，OD450逐漸升高，35 d達(dá)到峰值(圖4)。

圖4 免疫牛的intimin抗體檢測Fig.4 Detection of intimin antibodies from the immunized bovine

2.4.2 山羊抗體檢測 選擇2月齡山羊，首免14 d，血清OD450=0.66，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD450=1.01，S/P=0.65>0.31 ，二免14 d后OD450明顯升高(圖5)。

圖5 免疫山羊的intimin抗體檢測Fig.5 Detection of intimin antibodies from the immunized goats

3 討 論

產(chǎn)志賀毒素性大腸桿菌(Shiga toxigenicEscherichiacoli,STEC)是導(dǎo)致人類腹瀉和胃腸炎的重要食源性病原微生物，人感染后可能導(dǎo)致威脅生命的后遺癥，如溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic-syndrome，HUS) 和血栓性血小板減少紫癜(Thrombotic thrombocytopenic purpura，TPP)[14-15]。

志賀毒素(Shiga toxin,Stx)和LEE(locus of enterocyte effacement,LEE)毒力島是STEC O157∶H7和非O157∶H7兩個重要的毒力標(biāo)志。志賀毒素由整合到病原菌基因組的溶原性噬菌體編碼，分為Stx1和Stx2兩種，Stx1為胞內(nèi)毒素，Stx2為胞外毒素[16]。緊密素(Intimin)是LEE毒力島編碼的重要的毒力蛋白，編碼基因?yàn)閑ae，在病原菌定植腸道上皮細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[17]。2005-2010年期間，紐約公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室分離 STEC O157∶H7 132株，非O157∶H7的STEC 156株。所有STEC O157∶H7分離株，100 %菌株攜帶有eae基因，98 %菌株攜帶stx2，33 %攜帶有stx1。非O157∶H7 STEC 中，76 %菌株攜帶有eae基因，81 %攜帶有stx1，26 %菌株攜帶stx2，其中所有(100 %)O26、O103、O121和O145血清型菌株攜帶有eae基因，96 % O45菌株攜帶有eae基因，97 % O111菌株攜帶有eae基因[10-11]。由此可見，eae基因編碼的緊密素是STEC O157∶H7和非O157∶H7菌株極為重要的毒力因子，是建立檢測技術(shù)優(yōu)選的檢測靶標(biāo)。

目前，有關(guān)STEC研究大多數(shù)都是對抗原檢測方法進(jìn)行研究[18-21]，并且在流行病學(xué)調(diào)查中，多為根據(jù)已有的感染疫情進(jìn)行抗原檢測，缺乏對抗體的檢測方法的研究，因而有必要建立快速、簡便、特異的抗體檢測方法。ELISA 檢測法具有特異性強(qiáng)、靈敏性高和易操作性等特點(diǎn)，已在各種病原微生物的抗體監(jiān)測中廣泛應(yīng)用。本研究選擇緊密素為STEC抗體的檢測靶標(biāo)，建立ELISA技術(shù)，并組裝試劑盒，檢測動物血清中STEC抗體，為早期防控提供有效工具。

包被抗原特性是ELISA檢測技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。理想的包被抗原應(yīng)具備以下幾個特征：用于包被抗原為蛋白，且具有良好的抗原性；蛋白抗原以可溶性形式存在，避免包涵體；包被抗原具有通用性或者獨(dú)特性，通用性在于能夠兼顧多血清型病原的檢測，獨(dú)特性在于針對某些致病血清型辨別性好。本研究選擇intimin的27個亞型共有的N端保守性區(qū)段153 aa，體外高效表達(dá)，成功獲得可溶性重組蛋白，抗原性良好，30 ng/mL的工作濃度便能檢測血清中STEC緊密素抗體，有利于提高檢測方法的特異性和敏感性。羅玲等[22]體外表達(dá)STEC O157∶H7的整個intimin γ，作為包被抗原，建立了檢測禽STEC的間接ELISA。完整的intimin難于在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得可溶性表達(dá)，表達(dá)為包涵體蛋白，抗原性較差，包被濃度為880 ng/mL，相比本研究中包被濃度高近30倍，將大大提升試劑盒研制的成本。另外，包涵體蛋白為變性蛋白，相比可溶性蛋白所展示的表位和抗原性有明顯差異，可溶性蛋白具有與天然蛋白類似的空間表位和線性表位，而包涵體變性沒有空間表位只有線性表位，并且線性表位的展示往往不充分，將影響抗體檢測的特異性和敏感性。我們前期試驗(yàn)中，也曾選用pCold I質(zhì)粒體外嘗試表達(dá)了全長的intimin γ和intimin ε，重組蛋白全部以包涵體形式表達(dá)，在含有變性劑8M尿素條件下，Ni柱親和層析獲得純化蛋白，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，能夠與STEC O157∶H7全菌高免血清反應(yīng)，出現(xiàn)特異性條帶(本研究未顯示該數(shù)據(jù))，但清晰度明顯弱于本研究所選用的片段，與羅玲的報(bào)道一致，由此推測包涵體的變性蛋白免疫原性較差，導(dǎo)致ELISA包被中，包被蛋白濃度高抗血清反應(yīng)條帶。

緊密素ELISA試劑盒可以檢測牛和羊兩種動物STEC抗體。反芻動物是STEC重要的儲存宿主，及時、準(zhǔn)確的檢測牛羊STEC的抗體水平是保障人類健康的前提。以達(dá)到簡化程序的目標(biāo)，本研究嘗試用HRP-葡萄球菌A蛋白代替HRP-兔抗牛IgG和HRP-兔抗羊IgG，但HRP-葡萄球菌A蛋白與這兩種屬IgG親和力較差，導(dǎo)致OD450值明顯降低，相比之下HRP-葡萄球菌A蛋白與豬、鼠的IgG親和力好，提示可以替代HRP-羊抗豬IgG和HRP-羊抗小鼠IgG使用，研制不同種屬動物共同使用的ELISA試劑盒。本研究中的ELISA試劑盒，牛和羊所用酶標(biāo)二抗雖然不同，但二者的使用濃度達(dá)到了一致，在一定程度上體現(xiàn)出包被抗原與不同種屬抗血清均具有良好的結(jié)合能力。

綜上所述，本研究以27個緊密素亞型N端高度保守序列，體外成功獲得可溶性蛋白的高效表達(dá)、純化蛋白作為包被抗原，建立和組裝間接ELISA試劑盒，檢測牛群和羊群中STEC抗體水平，以監(jiān)測動物群免疫和感染后產(chǎn)志賀毒素性大腸桿菌抗體消長變化，為早期防控提供有效手段和指導(dǎo)。

[1]Karmali M A, Gannon V, Sargeant J M. Verocytotoxin-producingEscherichiacoli(VTEC) [J]. Veterianry Microbiology, 2010，140:360-370.

[2]王 燕.大腸桿菌O157∶H7感染流行概況[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2008，36(1)：51-58.

[3]徐建國，景懷奇.中國1997-1998年O157∶H7大腸桿菌檢測情況分析[J].疾病監(jiān)測，1999(5)：19-21.

[4]張 本，劉衡川，張朝武，等.四川省大腸桿菌O157∶H7分子流行病學(xué)、耐藥性及對消毒劑抗性研究[J].衛(wèi)生研究，2005(5)：606-610.

[5]Brooks J T, Sowers E G, Wells J G,et al. Non-O157 Shiga Toxin-ProducingEscherichiacoliInfections in the United States, 1983-2002[J]. J Infect Dis, 2005，192:1422-1429.

[6]Karmali M A, Gannon V, Sargeant J M. Verocytotoxin-producingEscherichiacoli(VTEC) [J]. Vet. Microbiol. , 2010,140: 360-370.

[7]Scallan E, Hoekstra R M, Angulo F J,et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens[J]. Emerg. Infect. Dis., 2011, 17: 7-15.

[8]Blanco M, Blanco J E, Dahbi G,et al. Typing of intimin (eae) genes from enteropathogenicEscherichiacoli(EPEC) isolated from children with diarrhoea in Montevideo, Uruguay:identification of two novel intimin variants (μB and ξR/ β2B) [J]. Journal of Medical Microbiology, 2006, 55:1165-1174.

[9]Blanco M, Blanco J E, Mora A, et al. Serotypes, virulence genes and intimin types of Shiga toxin (Verotoxin)-producingEscherichiacoliisolates from cattle in Spain:identification of a new intimin variant gene (eae-ξ) [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42:645-651.

[10]Posse B, De Zutter L, Heyndrickx M, et al. Quantitative isolation efficiency of O26, O103,O111, O145 and O157 STEC serotypes from artificially contaminated food and cattle faeces samples using a new isolation protocol[J]. J Appl Microbiol ,2008,105: 227-235.

[11]Perelle S, Dilasser F, Grout J and Fach P. Detection by 5￠-nuclease PCR of Shiga-toxin producingEscherichiacoliO26, O55, O91, O103, O111, O113, O145 and O157∶H7, associated with the world’s most frequent clinical cases[J]. Mol Cell Probes, 2004,18: 185-192.

[12]劉 潔，夏興霞，王永山，等.大腸桿菌O157∶H7抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的研制[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010,32(5):375-378.

[13]Zhang X, Yu Z, Zhang S, et al. Immunization with H7-HCP-Tir-Intimin significantly reduces colonization and shedding ofEscherichiacoliO157∶H7 in goats [J]. Plos One, 2014, 9(3): e91632.

[14]Gregory L A, Jill H , Morris J G. Emerging foodborne pathogens:EscherichiacoliO157∶H7 as a model of entry of a new pathogen into the food supply of the developed world [J]. Epidemiology Review, 1996,18:29-51.

[15]Iwamoto M, Huang J Y, Cronquist A B, et al. Bacterial enteric infections detected by culture-independent diagnostic tests——FoodNet, United States, 2012-2014[J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep., 2015,64(9):252-257.

[16]Bryan A, Youngster I, McAdam A J. Shiga Toxin ProducingEscherichiacoli[J]. Clin Lab Med. 2015,35(2):247-272.

[17]Kameyama M, Yabata J, Nomura Y, et al.Biochemical Features and Virulence Gene Profiles of Non-O157/O26 EnterohemorrhagicEscherichiacoliStrains from Humans in the Yamaguchi Prefecture, Japan[J]. Jpn J Infect Dis, 2015,68(3):216-220.

[18]Abbasi P, Kargar M, Doosti A, et al.Characterization of Shiga-toxin producingE.coli(STEC) and enteropathogenicE.coli(EPEC) using multiplex Real-Time PCR assays for stx1, stx2, eaeA [J]. Iran J Microbiol, 2014,6(3):169-174.

[19]Paoli G C, Wijey C, Uhlich G A.Genetically Marked Strains of Shiga Toxin-Producing O157∶H7 and Non-O157Escherichiacoli:Tools for Detection and Modeling [J]. J Food Prot, 2015,78(5):888-901.

[20]Qin X, Klein E J, Galanakis E, et al. Real-Time PCR Assay for Detection and Differentiation of Shiga Toxin-ProducingEscherichiacolifrom Clinical Samples [J]. J Clin Microbiol, 2015, 29(4):JCM.00115-15.

[21]張雪寒，張碧成，欒曉婷，等.遺傳標(biāo)志性基因 Z0372 PCR檢測腸出血大腸桿菌O157∶H7 [J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015,28(1)：409-413.

[22]羅 玲，茍 妙，羅青平，等.腸出血性大腸桿菌O157∶H7 eae 基因原核表達(dá)及間接ELISA 的初步建立[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014,53(14)：3423-3426.

(責(zé)任編輯 李山云)

Development of Indirect ELISA for Detecting Specific Antibody against STEC

ZHANG Xue-han, ZHANG Qiang, ZHANG Bi-cheng, WANG Wei, NI Yan-xiu, WEN Li-bin,LI Bin, ZHOU Jun-ming, HE Kong-wang，ZHOU Ping

(Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Engineering Research of Veterinary Bio-products of Agricultural Ministry；National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products,Jiangsu Nanjing 210014，China)

To monitor pathogenic Shiga toxigenicEscherichiacoli(STEC) infection and evaluate vaccination efficacy in animals and human, an indirect ELISA was developed based on antigens of N-end intimin from STEC. Based on N-end conserved region, the fragment of 390-543 aa was expressed in vitro using as coated antigen to develop an indirect ELISA. The sensitivity, specificity, repeatability and stability were analyzed to optimize the indirect ELISA. The working conditions of the indirect ELISA were as follows:the concentration of coating antigen was 3 ng/well, the dilution of primary serum and HRP-labeled rabbit anti-goat IgG, HRP-labeled rabbit anti-bovine IgG were 1∶200 and 1∶15000, respectively, 5 % skimmed milk blocked for l h. and the incubation time of coloration was 10 min. This indirect ELISA established in our study has good specificity, high sensitivity, good reproducibility, stability, and it is an effective tool to examine STEC infection and vaccination in animals and human to guide vaccine immunization and new vaccine development.

Shiga toxigenicEscherichiacoli; Intimin; Indirect ELISA; Bovine; Goat

1001-4829(2016)11-2738-08

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.042

2015-12-12

國家自然科學(xué)基金(31201919和31572503)；江蘇省自主創(chuàng)新資金[cx(15)1060]

張雪寒(1977-)，女，博士，副研究員，主要從事食源性病原微生物檢測技術(shù)研究，電話：025-84390331；E-mail：liuxuehan1996@hotmail.com。

S852.61

A