劉 娜 翁閃凡 張曉林 陳 姝

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000)

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鼻咽癌組織中己糖激酶2的表達(dá)及臨床意義

劉 娜 翁閃凡 張曉林 陳 姝1

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000)

目的 探討己糖激酶2(HK-Ⅱ)在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法 選擇鼻咽癌患者活檢組織25例作為觀察組，另取同期慢性鼻咽部炎癥患者活檢組織為對(duì)照組，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)兩組HK-Ⅱ mRNA的表達(dá)，采用免疫印跡法檢測(cè)兩組HK-Ⅱ蛋白表達(dá)。結(jié)果 觀察組HK-Ⅱ mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。鼻咽癌組織中HK-Ⅱ mRNA和蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；與年齡和性別無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 HK-Ⅱ的高度表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為鼻咽癌靶向治療的重要分子標(biāo)志物。

鼻咽癌；己糖激酶2；靶向治療

鼻咽癌是一種多基因遺傳疾病，其發(fā)病與遺傳易感性、環(huán)境因素、飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān)〔1〕。目前，鼻咽癌發(fā)病機(jī)制尚不清楚，且其解剖位置隱蔽、早期癥狀不典型，容易造成漏診、誤診，影響臨床治療。據(jù)報(bào)道〔2〕，鼻咽癌患者5年生存率僅為50%左右。不同病變程度的鼻咽癌患者放化療敏感性等方面存在差異，因此，篩選鼻咽癌早期診斷以及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物對(duì)其治療具有深遠(yuǎn)意義。己糖激酶2(HK-Ⅱ)在腫瘤組織異常糖酵解過程中發(fā)揮重要作用，是腫瘤細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者〔3〕，與腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)、侵襲等密切相關(guān)。本研究探討HK-Ⅱ在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平及其表達(dá)的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年10月至2015年11月本院收治鼻咽癌患25例，分別經(jīng)內(nèi)鏡取活檢組織作為觀察組；另選取同期我院20例慢性鼻咽部炎癥患者，取黏膜活檢組織為對(duì)照組。標(biāo)本取出后即放入-75℃冰箱保存。觀察組男17例，女8例；年齡24～77〔平均(45.82±12.07)〕歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例。對(duì)照組男15例，女5例；年齡22～74〔平均(44.10±13.51)〕歲。觀察組所有患者均未接受任何放化療治療，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷為低分化鱗狀細(xì)胞癌。兩組患者性別和年齡等基線資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 組織中HK-Ⅱ mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)兩組HK-Ⅱ mRNA的表達(dá)。采用Trizol法提取組織中的總RNA。(1)取活檢組織50 mg放入勻漿器，加入1 ml Trizol勻漿。(2)將勻漿液移入EP管，靜置5 min。(3)加入0.2 ml氯仿，震搖15 s，靜置2～3 min。(4)4℃、12 000 r/min離心15 min。(5)將最上層無色液體移至另一EP管。(6)加入異丙醇500 μl，上下顛倒EP管，混勻液體，靜置10 min。(7)4℃、12 000 r/min離心15 min，去除上清液。(8)加75%乙醇1 ml洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min，去除上清液。(9)加無水乙醇1 ml洗滌沉淀，室溫下干燥5～10 min。(10)加入無菌焦碳酸二乙酯(DEPC)水30 μl溶解沉淀。

1.2.2 組織中HK-Ⅱ蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫印跡法：(1)蛋白提?。杭羲榻M織，加入裂解液，充分勻漿裂解，10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。(2)蛋白變性：按照4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，PCR儀99℃變性10 min，-75℃冰箱保存。(3)測(cè)定提取標(biāo)本蛋白濃度：將試劑盒A液、B液混合成工作液配置蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入96孔板，每孔2 μl，加PBS補(bǔ)足20 μl；所有孔均加入二喹啉甲醛(BCA)工作液200 μl，溫箱孵育；測(cè)定濃度、繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。(4)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，用Image-Pro軟件掃描蛋白條帶OD值，HK-Ⅱ條帶/β-actin比值即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組HK-Ⅱ mRNAⅡ和蛋白表達(dá)對(duì)比 觀察組HK-Ⅱ mRNA表達(dá)(0.61±0.04)和HK-Ⅱ蛋白表達(dá)(0.49±0.15)均顯著高于對(duì)照組(0.06±0.03、0.11±0.05)(t=51.030、10.837，P<0.05)。

2.2 鼻咽癌組織HK-Ⅱ表達(dá)與臨床因素的關(guān)系 鼻咽癌組織中HK-Ⅱ mRNA和蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；與年齡和性別無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 HK-Ⅱ表達(dá)與臨床因素的關(guān)系

3 討 論

鼻咽癌患者早期臨床表現(xiàn)不典型，就診時(shí)約60%的患者出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移，約20%出現(xiàn)腦神經(jīng)受累，在積極治療后，仍有20%～30%的患者病情得不到有效控制，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等〔4，5〕。HK催化葡萄糖為6-磷酸葡萄糖，是催化糖酵解過程的第一步關(guān)鍵酶，在正常組織中含量很少，主要分布在肌肉、脂肪組織和肺組織中。HK有四種亞型：HK-Ⅰ、HK-Ⅱ、HK-Ⅲ、HK-Ⅳ，在腫瘤組織中HK-Ⅱ表達(dá)最為活躍〔6〕。HK-Ⅱ通過催化糖酵解過程中的產(chǎn)物被腫瘤細(xì)胞利用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。在Warburg效應(yīng)研究中〔7〕，發(fā)現(xiàn)HK-Ⅱ與腫瘤細(xì)胞糖酵解水平密切相關(guān)。HK-Ⅱ成為腫瘤生長(zhǎng)代謝中的分子干預(yù)靶點(diǎn)，可用于癌癥的分子靶向治療。Kwee等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，46.54%的肝細(xì)胞癌標(biāo)本檢測(cè)到HK-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)；彭國(guó)慶等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，HK-Ⅱ表達(dá)與宮頸癌病變程度正向相關(guān)；Sato-Tadano等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌轉(zhuǎn)移時(shí)HK-Ⅱ的生物活性及表達(dá)量均顯著增高。

HK-Ⅱ在腫瘤組織中的作用機(jī)制主要包括促進(jìn)葡萄糖代謝和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡兩個(gè)過程，HK-Ⅱ與線粒體外膜蛋白(VDAC)結(jié)合，形成線粒體結(jié)合型HK-Ⅱ，能夠選擇性的利用線粒體產(chǎn)生的三磷酸腺苷(ATP)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解過程。線粒體結(jié)合型HK-Ⅱ參與線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物(PTP)的構(gòu)建，能夠抑制促凋亡因子，阻止線粒體途徑誘導(dǎo)的凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，包括腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖〔11〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HK-Ⅱ的高度表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)，即高度表達(dá)的HK-Ⅱ能夠促進(jìn)糖酵解，為腫瘤生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)；與相關(guān)研究結(jié)果一致〔12〕。且糖酵解產(chǎn)生的酸性代謝物能夠破壞正常細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)一步為腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲提供有利環(huán)境。HK-Ⅱ的表達(dá)在不同年齡和性別鼻咽癌患者間尚未表現(xiàn)出顯著性差異，有待進(jìn)一步研究。

1 Xiao L,Hu ZY,Dong X,etal.Targeting epstein-barr virus oncoprotein LMP1-mediated glycolysis sensitizes nasopharyngeal carcinoma to radiation therapy〔J〕.Oncogene,2014;33(37):4568-78.

2 董 欣.鼻咽癌中糖酵解與脂肪酸β氧化異?；罨臋C(jī)制研究〔D〕.長(zhǎng)沙：中南大學(xué),2014.

3 陳麗霞.采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白〔D〕.桂林：廣西醫(yī)科大學(xué),2009.

4 Deng Q,Yu X,Xiao L,etal.Neoalbaconol induces energy depletion and multiple cell death in cancer cells by targeting PDK1-PI3-K/Akt signaling pathway〔J〕.Cell Death Dis,2013;4:e804.

5 郝俊芳,楊新華,董 偉,等.鼻咽癌的個(gè)體化治療〔Z〕.山東省醫(yī)學(xué)科技三等獎(jiǎng),2012.

6 姜漢國(guó).PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究〔D〕.濟(jì)南：山東大學(xué),2010.

7 魏 婷.下調(diào)N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNB-2惡性生物學(xué)行為的影響〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué),2011.

8 Kwee SA,Hernandez B,Chan O,etal.Choline kinase alpha and hexokinase-2 protein expression in hepatocellular carcinoma:association with survival〔J〕.PLoS One,2012;7(10):e46591.

9 彭國(guó)慶,尹紅玲,田 焱,等.糖酵解限速酶HK-2與宮頸組織癌變的關(guān)系〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010;26(9):941-2.

10 Sato-Tadano A,Suzuki T,Amari M,etal.Hexokinase II in breast carcinoma:a potent prognostic factor associated with hypoxia-inducible factor-1α and Ki-67〔J〕.Cancer Sci,2013;104(10):1380-8.

11 Shen YA,Wang CY,Hsieh YT,etal.Metabolic reprogramming orchestrates cancer stem cell properties in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cell Cycle,2015;14(1):86-98.

12 梁莉麗,孫 迪,宋海濤,等.局部晚期鼻咽癌患者外周血VEGF檢測(cè)及意義〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015;15(3):510-3.

〔2015-10-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

2012年佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.201208065)

張曉林(1960-)，男，碩士，副教授，主要從事重大疾病生化與分子機(jī)制方面的研究。

劉 娜(1978-)，女，碩士，講師，主要從事腫瘤能量代謝方面的研究。

R76

A

1005-9202(2016)22-5616-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.055

1 佛山市第一人民醫(yī)院臨床研究所