陳 強(qiáng) 陳麗珠 郭曉華
(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,內(nèi)蒙古 包頭 014010)
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丹參酮通過抑制miR-376b-5p逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠左室重構(gòu)
陳 強(qiáng) 陳麗珠 郭曉華
(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,內(nèi)蒙古 包頭 014010)
目的 探討miR-376b-5p在丹參酮逆轉(zhuǎn)老年自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左室重構(gòu)中的作用。方法 將60只17月齡的SHR隨機(jī)分為對(duì)照組、丹參酮組和丹參酮+miR-376b-5p組(n=20),其中丹參酮組和丹參酮+miR-376b-5p組接受5 ml·kg-1·d-1的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液灌胃處理,連續(xù)12 w;此外,丹參酮+miR-376b-5p組尾靜脈注射過表達(dá)miR-376b-5p的慢病毒載體,對(duì)照組接受5 ml·kg-1·d-1的生理鹽水灌胃處理。12 w后分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,采用PowerLab生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)分析血壓及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)〔左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP) 和左心室壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)〕,稱量體質(zhì)量及左心室質(zhì)量并計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)。取左心室中部冠狀切面石蠟切片行HE染色、Masson染色以評(píng)估左室重構(gòu)情況(心肌細(xì)胞直徑、心肌間質(zhì)纖維化指數(shù)和心肌血管周圍纖維化指數(shù))。結(jié)果 與對(duì)照組相比,丹參酮組的收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓及LVSP和LVEDP均降低,±dp/dt max均升高(P<0.05);丹參酮組的左心室質(zhì)量、左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌細(xì)胞直徑、心肌間質(zhì)纖維化指數(shù)及心肌血管周圍纖維化指數(shù)均低于對(duì)照組。miR-376b-5p過表達(dá)后可消除丹參酮對(duì)SHR血壓及左心室重構(gòu)的保護(hù)效果,丹參酮+miR-376b-5p組的以上指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 丹參酮對(duì)老年SHR左室重構(gòu)有保護(hù)作用,而過表達(dá)miR-376b-5p可消除丹參酮對(duì)老年SHR左室重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)作用,提示丹參酮可能通過降低miR-376b-5p水平發(fā)揮對(duì)老年SHR左室重構(gòu)的保護(hù)作用。
miR-376b-5p;丹參酮;自發(fā)性高血壓;左室重構(gòu)
左室重構(gòu)是高血壓患者發(fā)生心血管事件的重要危險(xiǎn)因素,主要包括心肌肥大及心肌纖維化,前者為心肌纖維對(duì)慢性壓力或容量負(fù)荷的適應(yīng)性反應(yīng),后者是心肌肥大過程中伴有膠原纖維過度沉積,最終導(dǎo)致心功能惡化〔1,2〕。目前在高血壓治療中,理想的治療措施應(yīng)在有效降壓的同時(shí)對(duì)左室重構(gòu)有改善效果。丹參酮具有較廣泛的心血管保護(hù)作用,同時(shí)對(duì)心室重構(gòu)有較好的保護(hù)作用〔3,4〕。MicroRNAs(miRNAs)可調(diào)控基因的表達(dá),且在多種心血管病理過程中發(fā)揮作用,如心肌纖維化、心肌肥厚、心力衰竭與心律失?!?~7〕。miR-376b-5p是一種具有多種生物活性的microRNA,可參與M3受體對(duì)心肌的保護(hù)作用〔8〕,同時(shí)可調(diào)控腦缺血后血管新生〔9〕。本研究在老年自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)中發(fā)現(xiàn),miR-376b-5p參與了丹參酮對(duì)老年SHR左室重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)過程。
1.1 主要試劑及儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液購(gòu)自上海第一生化有限公司,高表達(dá)miR-376b-5p的慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司,PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)AD Instruments公司,Masson三色染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物科技開發(fā)公司,HE染色液購(gòu)自徐州博立達(dá)生物技術(shù)有限公司。
1.2 動(dòng)物與分組 60只17月齡的SHR購(gòu)自北京維通利華公司,體重400~420 g,隨機(jī)分為對(duì)照組、丹參酮組和丹參酮+miR-376b-5p組(n=20),其中丹參酮組和丹參酮+miR-376b-5p組接受5 ml·kg-1·d-1的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液灌胃處理,連續(xù)12 w;此外,丹參酮+miR-376b-5p組尾靜脈注射0.1 ml過表達(dá)miR-376b-5p的慢病毒載體,對(duì)照組接受5 ml·kg-1·d-1的生理鹽水灌胃處理。所有大鼠均飼養(yǎng)于同一SPF環(huán)境中,自由攝食與飲水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃,相對(duì)濕度45%~65%,光照與黑暗周期為12 h/12 h。
1.3 無(wú)創(chuàng)尾袖法測(cè)定血壓 每組取8只大鼠,將大鼠置于配套固定器中,溫水浸泡軟化尾巴,采用PowerLab ML125/R無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析系統(tǒng)測(cè)定大鼠血壓。重復(fù)3次,取均值。
1.4 血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià) 12 w后對(duì)各組大鼠進(jìn)行稱重,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg后固定,行頸部正中切口,暴露氣管后插管連接呼吸機(jī)維持呼吸(50次/min),游離右側(cè)頸總動(dòng)脈并于其表面切一小口,將PE-50聚乙烯管(充滿50 U/ml肝素生理鹽水)向近心端插入并結(jié)扎固定,經(jīng)PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)記錄收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP),并對(duì)血壓信號(hào)進(jìn)行處理,記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)。進(jìn)一步插管進(jìn)入左心室內(nèi)監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),包括左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP) 和左心室壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。
1.5 心臟解剖學(xué)指標(biāo) 待完成血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)后記錄各組大鼠體質(zhì)量,過量麻醉處死大鼠后,迅速開胸取出心臟組織,清洗后移除心房及右心室游離壁,稱重左心室,同時(shí)根據(jù)公式計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù):左心室質(zhì)量指數(shù)=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。
1.6 心臟病理學(xué)指標(biāo) 待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每組取8只大鼠采用靜脈注射過量的KCl使心臟收縮停止于舒張期,迅速開胸取出心臟組織,清洗后依次經(jīng)4%中性甲醛固定、梯度酒精脫水及二甲苯透明后,適當(dāng)修剪組織,取左心室中部冠狀切面進(jìn)行石蠟包埋,石蠟切片機(jī)制備5 μm切片,每個(gè)組織樣本取5張切片分別進(jìn)行HE染色以測(cè)量單個(gè)心肌細(xì)胞直徑及Masson染色測(cè)量心肌間質(zhì)和心肌血管周圍膠原分布情況,最后計(jì)算心肌間質(zhì)纖維化指數(shù)和心肌血管周圍纖維化指數(shù),共同評(píng)價(jià)心肌纖維化情況。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件,多組計(jì)量資料分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA檢驗(yàn)),兩兩比較采用SNK法。
2.1 3組大鼠的血壓及心率比較 3組大鼠心率無(wú)顯著差異(P>0.05),丹參酮組的SBP、DBP及MAP均低于對(duì)照組(P<0.05);與丹參酮組比較,丹參酮+miR-376b-5p組的SBP、DBP及MAP均升高,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而丹參酮+miR-376b-5p組以上指標(biāo)與對(duì)照組(P>0.05)。見表1。
表1 3組大鼠的血壓水平及血流動(dòng)力學(xué)情況±s)
與對(duì)照組比較:1)P<0.05;與丹參酮組比較:2)P<0.05;下表同
2.2 3組大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 丹參酮組的LVSP和LVEDP均低于對(duì)照組,dp/dtmax和-dp/dtmax均高于對(duì)照組(P<0.05);與丹參酮組比較,丹參酮+miR-376b-5p組的LVSP和LVEDP均升高,dp/dtmax和-dp/dtmax水平降低(P<0.05),且丹參酮+miR-376b-5p組以上指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。
2.3 3組大鼠的心臟解剖學(xué)指標(biāo)比較 3組大鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);丹參酮組的左心室質(zhì)量及左心室質(zhì)量指數(shù)均低于對(duì)照組(P<0.05);與丹參酮組比較,丹參酮+miR-376b-5p組的左心室質(zhì)量及左心室質(zhì)量指數(shù)均升高(P<0.05),且丹參酮+miR-376b-5p組以上指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。
表3 3組大鼠的心臟解剖學(xué)指標(biāo)比較±s)
2.4 3組大鼠的心臟病理學(xué)指標(biāo)比較 丹參酮組的心肌細(xì)胞直徑、心肌間質(zhì)纖維化指數(shù)及心肌血管周圍纖維化指數(shù)均低于對(duì)照組(P<0.05);與丹參酮組比較,丹參酮+miR-376b-5p組的心肌細(xì)胞直徑、心肌間質(zhì)纖維化指數(shù)及心肌血管周圍纖維化指數(shù)均升高(P<0.05),且丹參酮+miR-376b-5p組以上指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表4。
表4 3組大鼠的心臟病理學(xué)指標(biāo)比較±s)
長(zhǎng)期高血壓會(huì)導(dǎo)致心室重構(gòu),主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大及纖維化,后者可分為心肌間質(zhì)纖維化和心肌血管纖維化〔2〕。心肌纖維化增加了心臟中非心肌細(xì)胞比例,嚴(yán)重影響心室功能,最終導(dǎo)致心力衰竭。丹參酮是傳統(tǒng)中藥丹參的心血管活性成分,具有改善微循環(huán)、抗氧化及抗炎等作用〔10〕。在老年高血壓動(dòng)物模型中的研究還證實(shí)丹參酮具有確切的抗心室重構(gòu)作用〔11〕,但其具體機(jī)制尚不清楚。
miRNA是一類具有廣泛調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源性RNA,能與靶基因的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合從而對(duì)靶mRNA進(jìn)行調(diào)控。目前大量的miRNA被發(fā)現(xiàn)參與了心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展過程,如miR-133、miR-99a、miR-30及miR-34等〔5~7〕。Pan等〔8〕發(fā)現(xiàn)M3亞型乙酰膽堿受體可通過抑制miR-376b-5p發(fā)揮心肌保護(hù)作用。此外,通過miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan發(fā)現(xiàn),胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-2、ryanodine受體2及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子均參與了心肌缺血的調(diào)控過程〔12,13〕。本研究表明丹參酮可改善心室重構(gòu)。通過基因載體手段過表達(dá)miR-376b-5p,發(fā)現(xiàn)接受丹參酮處理后大鼠的心室重構(gòu)指標(biāo)無(wú)變化,直接證實(shí)過表達(dá)miR-376b-5p可消除丹參酮對(duì)老年SHR心室重構(gòu)的改善效果,可能通過影響其靶基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)丹參酮的心血管保護(hù)作用。
此外,本研究發(fā)現(xiàn)miR-376b-5p對(duì)丹參酮改善老年SHR血壓及血流動(dòng)力學(xué)的作用亦有逆轉(zhuǎn)效果,由于較高的基礎(chǔ)血壓和異常血流動(dòng)力學(xué)狀況可影響心室重構(gòu)的進(jìn)程,本研究推測(cè)miR-376b-5p可能通過影響血壓及血流動(dòng)力學(xué)參與對(duì)丹參酮作用的調(diào)控。
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〔2015-12-19修回〕
(編輯 徐 杰)
陳 強(qiáng)(1980-),男,主治醫(yī)師,碩士,主要從事冠心病診治研究。
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A
1005-9202(2016)22-5549-03;
10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.024