趙 軍 趙美琴 董合玲 徐曉陽

(暨南大學生物醫(yī)學工程博士后流動站暨南大學體育學院，廣東 廣州 510630)

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不同強度有氧運動對非酒精性脂肪肝炎大鼠肝線粒體增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

趙 軍 趙美琴1董合玲 徐曉陽2

(暨南大學生物醫(yī)學工程博士后流動站暨南大學體育學院，廣東 廣州 510630)

目的 研究不同強度運動對非酒精性脂肪肝炎(NASH)大鼠肝線粒體增殖相關(guān)調(diào)節(jié)因子的影響。方法 SD大鼠隨機分為普通安靜組(ND組)和高脂組，高脂組分為安靜對照組(C組)和運動組，分別以普通或高脂飼料喂養(yǎng)16 w，后6 w運動各組進行跑臺運動。結(jié)束時測血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和血脂，肝勻漿超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，肝煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶依賴的組蛋白去乙酰代酶(SIRT1)、過氧化物增殖物激活受體γ輔因子(PGC-1)α、核呼吸因子(NRF)-1、mtDNA轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)mRNA和SIRT1、AMPK、pAMPK蛋白表達，肝HE染色切片。結(jié)果 C組發(fā)生NASH；運動各組NAS和氧化應(yīng)激不同程度緩解；中等、較大強度運動能顯著升高SIRT1、pAMPK蛋白表達和SIRT1、PGC-1α、NRF-1、TFAM mRNA水平。結(jié)論 中等和較大強度運動激活SIRT1/AMPK/PGC-1α信號通路，促進線粒體增殖，降低氧化應(yīng)激水平，抑制炎癥的發(fā)生。

有氧運動；非酒精性脂肪肝炎；SIRT1；AMPK；PGC-1α

我國非酒精性脂肪肝病(NAFLD)發(fā)病率隨著年齡的增加而升高，在50～60歲達到峰值〔1，2〕。非酒精性脂肪肝炎(NASH)是NAFLD進一步發(fā)展的結(jié)果。氧化應(yīng)激被認為是NASH發(fā)病的重要因素之一，而肝細胞線粒體功能紊亂〔3〕在氧化應(yīng)激中起著重要的作用。過氧化物增殖物激活受體γ輔因子α(PGC-1α)是調(diào)節(jié)線粒體增殖的重要因子，可調(diào)節(jié)核呼吸因子(NRF)-1、NRF-2、mtDNA轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)活性，促進線粒體呼吸鏈相關(guān)基因表達和mtDNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶依賴的組蛋白去乙?；?SIRT)1調(diào)控著肝PGC-1α的活性〔4〕。NASH肝細胞線粒體增生明顯受損〔5〕，患者或動物肝細胞SIRT1、AMPK、PGC-1α表達或活性顯著性減少〔5〕。有氧運動可抑制NAFLD進展，而較大強度運動與NASH顯著負相關(guān)〔6〕，但具體機制不清。本文探討NASH肝臟對不同強度運動的分子適應(yīng)機制，闡明中等及較大強度運動的抗脂肪性肝炎的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SPF級成年SD大鼠50只，廣東中醫(yī)藥大學動物中心提供，體重150～160 g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機分為普通安靜組(ND組)，高脂安靜對照組(C組)和高脂小強度運動組(LE組)、高脂中等強度運動組(ME組)、高脂較大強度運動組(VE組)。普通組給予普通飼料，高脂組給予高脂飼料，共計16 w。普通飼料配方中脂肪提供能量占18%、蛋白質(zhì)占32%、碳水化合物占50%；高脂飼料配方中脂肪提供能量約占60%、蛋白質(zhì)占20%、碳水化合物占20%。大鼠自由飲食，環(huán)境溫度22℃～25℃，自然光照。

1.2 運動方案第11周運動各組開始跑臺運動，5 d/w，60 min/d。適應(yīng)性訓練后，各組運動速度分別是：LE組：15 m/min；ME組：20 m/min；VE組：25 m/min(30 min)和30 m/min(30 min，10%)，分別大致相當于30%VO2max、55% VO2max、75% VO2max左右的運動強度。

1.3 取材 第16周最后一次運動后即刻取材。采腹主動脈血10 ml，分離血清于-80℃保存。剪下肝臟于中葉中間位切取1 cm×1 cm×1 cm大小肝組織，濾紙拭干血跡，置于10%甲醛溶液中固定保存，用于HE染色；取小塊肝中葉若干分裝于凍存管，置于液氮罐備用。

1.4 指標測定

1.4.1 血清生化指標的測定 血甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)通過7020全自動生化分析儀(HITACH公司)測定。

1.4.2 肝組織病理 切片常規(guī)行HE染色，鏡下觀察脂肪變性、小葉性炎癥、氣球樣變，評估NAFLD活動度積分(NAS)。

1.4.3 RT-PCR測定肝SIRT1、PGC-1α、NRF-1、TFAM mRNA表達 Trizol一步法提取肝臟總RNA，選取質(zhì)量和純度符合RT-PCR要求的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄后，在CFX96 realtime PCR儀(Bio-Rad公司)上進行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件，擴增曲線階段： 95℃30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；70℃，30 s，40個循環(huán)；融解曲線階段：融解溫度區(qū)間為55℃～95℃，讀數(shù)間隔為0.5℃，每次持續(xù)時間為2 s。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算各樣品目的基因的相對表達量。擴增引物。SIRTI正義鏈5′CTGTTTCCTGTGGGATACCTGACT 3′;反義鏈5′ATCGAACATGGCTTGAGGATCT 3′;PGC-1α正義鏈5′AAA AGCTTGACTGGCGTCAT 3′;反義鏈5′TCAGGAAGATCTGGGCAAAG 3′;NRF-1正義鏈5′CGCAGTGACGTCCGCACAGA 3′;反義鏈5′AAGGTCCTCCCGCCCATGCT3′;TFAM正義鏈5′GGCAGAAACGCCTAA AGAAG 3′;反義鏈5′TCATCCTTAGCCTCCTGGAA 3′;β-actin正義鏈5′TTCCTGGGTATGGAATCCTG 3′;反義鏈5′CAGCAATGCCTGGGTACAT。引物合成于廣州Invitrogen公司。

1.4.4 Western 印跡測定肝組織SIRT1、AMPK、pAMPK蛋白水平 提取肝組織100 mg放入試管，加入RIPA 900 μl冰浴勻漿，后立即放入100 μl PMSF液，再將其轉(zhuǎn)移至離心管中，并加40 μl完全緩沖液，4℃，1 000 r/min離心10 min，取上清分裝，-20℃保存，用考馬斯亮法定蛋白樣品濃度。常規(guī)蛋白電泳分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度4%。抽提純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用麗春紅染色，確定蛋白轉(zhuǎn)移成功，5%脫脂奶封閉后，加一抗(phospho-AMPK 1∶1 000；AMPK 1∶800；SIRT 1∶1 000)，室溫下孵育2.5 h，PBST洗膜后，加二抗(羊抗鼠，1∶1 000)，室溫下孵育1 h。PBST洗膜后，NBT+BCIP顯色；SYNGENE成像系統(tǒng)進行圖像分析。

1.4.5 肝組織勻漿測定SOD和MDA SOD活性的測定采用黃嘌呤氧化酶分析法；MDA水平的測定采用硫代巴比妥酸分析法(試劑盒購于南京建成生物公司)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清生化指標水平 實驗結(jié)束時，血脂方面，運動組血TC、LDL-C和TG水平均顯著性低于C組(P<0.05)，而運動各組之間無顯著差異(P>0.05)；運動組的血ALT、較C組顯著減少(P<0.05)；VE組血清ALT較LE組顯著減少(P<0.05)。見表1。

2.2 肝組織勻漿SOD活性、MDA含量 運動組肝組織MDA含量較C組顯著下降，SOD較C組顯著升高；VE組較LE組肝組織SOD活性顯著升高(均P<0.05)。見表1。

2.3 HE染色肝組織病理學光鏡下觀察 C組肝細胞索境界不清，彌漫性脂質(zhì)空泡，大小不等，氣球樣變明顯，中度至重度大囊泡脂肪變性廣泛分布，并可見廣泛的小葉內(nèi)炎癥浸潤病灶，結(jié)果顯示C組大鼠全部發(fā)生NASH；LE組大鼠肝小葉內(nèi)可見彌漫性脂肪大小泡分布，脂肪大泡摻雜其間，小葉內(nèi)炎性病灶減輕，LE組7只大鼠進入NASH階段；ME、VE組大鼠肝組織尚可見彌漫性脂肪小泡，脂肪大泡明顯減少，炎性病灶明顯減輕，ME組1只大鼠進入NASH階段，LE組無進入NASH階段大鼠。高脂各組NAS評分，C組8分，LE組5.4分，ME組3.4分，VE組2.8分，NAS評分上LE、ME、VE組較C組顯著下降(P<0.05;P<0.01)，ME較LE有顯著性減少(P<0.01)，VE較LE和ME組有顯著性下降(P<0.01，P<0.05)。

2.4 肝組織SIRT1、PGC-1α、NRF-1、TFAM mRNA表達 RT-PCR結(jié)果表明，C組SIRT1、PGC-1α、NRF-1、TFAM mRNA表達較ND組顯著性減少(P<0.01)，而運動各組較C組有顯著升高(P<0.05)；ME組各基因表達顯著高于LE組；VE組各基因表達均顯著高于ME組(P<0.05)。見表2。

2.5 肝組織SIRT1、AMPK、pAMPK蛋白表達 C組大鼠肝臟Sirt1蛋白表達顯著下降(P<0.01)，LE組SIRT1蛋白與C組無顯著差異，VE組、ME組SIRT1蛋白表達較C組顯著升高(P<0.01)，且高于LE組，VE組顯著高于ME組(P<0.05)；C組大鼠肝臟pAMPK/AMPK比值顯著減少(P<0.01)，VE和ME組pAMPK/AMPK較C組顯著升高(P<0.01)，LE組與C組無顯著差異(P<0.05)，VE組顯著高于ME組(P<0.05)。

表1 各組大鼠血脂、ALT及肝組織、SOD、MDA水平比較

與C組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與LE組比較：3)P<0.05,4)P<0.01;與ME組比較：5)P<0.05,6)P<0.01，下表同

表2 肝組織SIRT1、PGC-1α、NRF-1、TFAM mRNA及SIRT1、pAMPK/AMPK蛋白表達水平

3 討 論

有氧運動抑制NAFLD向NASH發(fā)展方面研究較少，其機制仍不清楚。本文表明中等及較大強度有氧運動抑制大鼠脂肪性肝炎效果顯著，其機制與促進線粒體增殖，改善線粒體功能紊亂，抑制氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

“多次打擊”學說認為脂肪因子的改變、脂質(zhì)過氧化物和氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂、血內(nèi)源性毒性物質(zhì)、肝星狀細胞激活等均是NASH發(fā)病誘因，線粒體功能紊亂是其中的重要致病因素。Begriche等〔3〕發(fā)現(xiàn)進展性NAFLD患者，線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，線粒體合成ATP的功能下降、線粒體DNA含量減少以及線粒體呼吸功能下降。肝細胞線粒體增殖異常在NASH發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用〔5〕，NASH小鼠肝細胞線粒體增殖功能顯著受損，線粒體增殖的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AMPK、SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM表達均顯著減少，細胞色素氧化酶4也顯著減少〔7〕。本文C組大鼠肝線粒體增殖轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AMPK、SIRT1、PGC-1α、NRF-1和TFAM mRNA表達顯著下降。

PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體增殖的關(guān)鍵因子，通過NRF-1、NRF-2、TFAM促進線粒體相關(guān)基因表達。上游因子SIRT1去乙?；疨GC1α促進線粒體增殖，pAMPK磷酸化并激活PGC1α〔8〕。肝脂聯(lián)素信號傳導(dǎo)中，SIRT1是AMPK上游信號因子〔9〕。SIRT1/AMPK/PGC-1α軸異常在NASH發(fā)病機制、脂肪性肝炎發(fā)展中有重要作用。高脂喂養(yǎng)大鼠3個月后，肝SIRT mRNA表達顯著性降低〔10〕；肝pAMPK蛋白表達減少在NASH發(fā)病過程中也起著重要作用〔11〕。本文中高脂飲食對肝細胞SIRT1/AMPK/PGC-1α信號通路顯著性抑制，C組大鼠肝細胞SIRT1表達和pAMPK表達顯著減少、PGC-1α、NRF-1、TFAM基因表達顯著性減少。所以肝細胞SIRT1/AMPK/PGC-1α軸可能是NAFLD治療的重要靶點〔7〕，刺激NASH肝細胞SIRT1/AMPK/PGC-1α信號通路可以顯著改善脂肪肝細胞線粒體功能紊亂，促進線粒體增殖，增加脂肪酸氧化、減少ROS生成和氧化應(yīng)激，抑制單純性脂肪肝向脂肪性肝炎方向的發(fā)展。

有氧運動可調(diào)節(jié)組織SIRT1、AMPK的表達，隨著運動強度的增加，SIRT1、pAMPK表達也逐漸增加，表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系〔12〕。Takekoshi等〔13〕研究表明較大強度的有氧運動可激活肝細胞AMPK；Carlson等〔14〕發(fā)現(xiàn)一次小強度(16 m/min，120 min)有氧運動后，大鼠肝臟AMPK活沒有顯著性變化，運動后第15分鐘也只輕微增加；而較大強度(32 m/min，15%，10 min)運動后肝臟AMPK活性顯著升高，并且伴隨著AMPK下游蛋白乙酰輔酶A羧化酶(ACC)磷酸化水平的增加；Bayod等〔15〕用小強度跑臺運動(12 m/min,4～5 d/w,36 w)訓練大鼠后發(fā)現(xiàn)，肝臟pAMPK/AMPK并無顯著性增加。運動對骨骼肌組織中SIRT1表達顯示出顯著的劑量依賴關(guān)系〔16〕；Leiz等〔17〕也發(fā)現(xiàn)中等強度運動可以顯著增加小鼠肝細胞SIRT1蛋白表達。本文認為中等及較大強度有氧運動比小強度運動抑制NASH效果更顯著，較顯著地抑制脂肪肝炎性的病變，其機制與激活SIRT1/AMPK/PGC-1α信號通路的傳導(dǎo)，促進線粒體增生、增加脂肪酸的氧化和減少氧化應(yīng)激的作用相關(guān)。

高分子量脂聯(lián)素和瘦素可以促進肝組織SIRT1、pAMPK的表達；而脂聯(lián)素、瘦素受體的表達與運動強度之間呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。Mohebbi等〔18〕讓大鼠分別小(20 m/min，大約為50%～55% VO2max)、中(28 m/min，大約為70%～75% VO2max)、大(34 m/min，大約為80%～85% VO2max)強度進行12 w的跑臺運動后，血液、脂肪組織中的總脂聯(lián)素以及高分子量脂聯(lián)素水平顯著增加，高分子量脂聯(lián)素水平與運動強度之間呈現(xiàn)顯著劑量依賴關(guān)系。瘦素也可激活肝細胞內(nèi)AMPK，而瘦素和瘦素受體表達也與運動強度相關(guān)〔19〕。

總之，小強度、中等強度和較大強度有氧運動能直接抑制高脂飲食導(dǎo)致大鼠肝臟內(nèi)的脂肪沉積，降低NAFLD活動度評分，對NAFLD起著輔助治療作用；中等和較大強度有氧運動抑制單純性脂肪肝向脂肪肝炎轉(zhuǎn)化比小強度運動有更顯著的效果，其機制可能與AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路的激活有關(guān)。

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〔2015-05-29修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

趙 軍(1971-),男,副教授,博士,主要從事營養(yǎng)與運動生物化學研究。

G804.7

A

1005-9202(2016)22-5529-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.016

1 武漢西藏中學 2 華南師范大學體育科學學院