萬(wàn)英明 張玉影 張璐妮 邵 玉 寧明杰 唐 英 姜 暢 齊 玲 于洪泉

(吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬465醫(yī)院,吉林 吉林 132013)

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表皮生長(zhǎng)因子對(duì)牙周成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

萬(wàn)英明 張玉影1張璐妮1邵 玉1寧明杰1唐 英1姜 暢1齊 玲1于洪泉2

(吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬465醫(yī)院,吉林 吉林 132013)

目的 研究表皮生長(zhǎng)因子對(duì)人牙周成纖維細(xì)胞增殖的作用。方法 原代培養(yǎng)人牙周成纖維細(xì)胞，MTT法檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子作用后牙周成纖維細(xì)胞的增殖情況，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)。結(jié)果 各濃度表皮生長(zhǎng)因子均可以促進(jìn)牙周成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，與正常對(duì)照組比較，36 h 20 ng/ml 組、72 h 10和20 ng/ml組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中cyclinD1的表達(dá)增加，20 ng/ml組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 表皮生長(zhǎng)因子通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)而促進(jìn)牙周成纖維細(xì)胞的增殖。

牙周萎縮;表皮生長(zhǎng)因子;牙周成纖維細(xì)胞;cyclinD1

牙周萎縮出現(xiàn)時(shí)對(duì)患者可產(chǎn)生不同的影響，如影響美觀、牙痛、牙齒松動(dòng)、遇冷熱后出現(xiàn)癥狀等，這些都給患者帶來(lái)了極大的痛苦。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡，在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮十分重要的作用〔1～3〕。本研究主要探討EGF對(duì)牙周成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源與試劑 人牙周成纖維細(xì)胞取自12歲左右因正畸需要拔除的健康前磨牙的齦乳頭組織。DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，0.25%胰酶和小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，四甲基偶氮唑(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，EGF購(gòu)自英國(guó)PeproTech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)〔4〕取健康12歲左右正畸拔除的前磨牙，置入青、鏈霉素中清洗3次，再用DMEM培養(yǎng)基沖洗3～5次，將牙根周圍組織剪成1 mm×1 mm×1 mm碎塊，將組織塊平鋪于10 cm2培養(yǎng)皿中，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。從第3日起觀察是否有細(xì)胞長(zhǎng)出，棄去壞死和污染組織，每3 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第3代后細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 以每孔8×103個(gè)細(xì)胞的密度將牙周成纖維細(xì)胞均勻接種于96孔板中，置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)過(guò)夜。次日加入EGF(濃度分別為0、2.5、5、10、20 ng/ml，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別作用36和72 h。實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入MTT 20 μl繼續(xù)孵育，棄上清后每孔加入DMSO 150 μl振蕩溶解，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔490 nm處的吸光度值。

1.2.3 ELISA實(shí)驗(yàn) 用2.5、5、10、20 ng/ml的EGF處理牙周成纖維細(xì)胞72 h，設(shè)空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)終止后收集培養(yǎng)上清，與包被液按1∶1比例包被后4℃過(guò)夜。封閉1 h，加入cyclin D1抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過(guò)夜。次日加入二抗(1∶1 000稀釋)37℃下孵育1.5 h。室溫避光顯色，顏色呈棕黃色變化時(shí)終止顯色。自動(dòng)酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 EGF對(duì)牙周成纖維細(xì)胞增殖的影響 2.5、5、10和20 ng/ml的EGF在作用牙周成纖維細(xì)胞36和72 h均可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，與正常對(duì)照組比較，36 h時(shí)20 ng/ml EGF組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，72 h時(shí)10和20 ng/ml EGF組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在牙周成纖維細(xì)胞中，EGF作用具有明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)。見表1。

2.2 EGF影響牙周成纖維細(xì)胞cyclinD1的表達(dá) EGF各濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清中cyclinD1蛋白分泌增加，與空白對(duì)照組(0.56±0.05)比較，20 ng/ml濃度組(0.76±0.11)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。2.5、5、10 ng/ml組分別為0.58±0.06、0.61±0.03、0.68±0.06。

表1 不同濃度EGF對(duì)牙周成纖維細(xì)胞增殖的影響±s,n=5)

與0 ng/ml比較:1)P<0.05

3 討 論

牙周萎縮的發(fā)生主要由兩種情況引起，一種是生理性萎縮，是由于年齡增長(zhǎng)使牙根暴露造成的；另外一種是病理性萎縮，是由于牙周炎癥、長(zhǎng)期刷牙方法不當(dāng)?shù)纫稹?〕。牙周萎縮發(fā)生時(shí)無(wú)特殊有效的治療方法，主要方法是注意口腔衛(wèi)生及生活習(xí)慣、改正不正確的刷牙方法、有較深的楔狀缺損按齲齒及牙髓病治療、牙周外科手術(shù)(如側(cè)向齦瓣轉(zhuǎn)移術(shù)等)整復(fù)〔6〕。但這些方法對(duì)于牙周萎縮的治療不能起到根本性的作用。生長(zhǎng)因子是一類能促進(jìn)局部組織細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)〔7〕，EGF作用于細(xì)胞后，與細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR結(jié)合，繼而引起EGFR的自身磷酸化，從而啟動(dòng)下游的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起一系列的生物學(xué)效應(yīng)〔8〕。研究表明，EGF可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)輸卵管上皮細(xì)胞和舌背黏膜細(xì)胞的增殖；也可以促進(jìn)角膜緣上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)〔9～11〕。EGF還可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，進(jìn)而促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)〔12〕。EGF單抗也可促進(jìn)人牙齦上皮細(xì)胞的增殖〔13〕。cyclinD1增加可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。因此，EGF可能通過(guò)增加細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)，從而促進(jìn)牙周成纖維細(xì)胞的增殖，雖然機(jī)制還需更多的數(shù)據(jù)來(lái)充實(shí)，但這些數(shù)據(jù)為EGF用于口腔科牙周疾病的治療提供了可行性。

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〔2016-03-17修回〕

(編輯 曲 莉)

吉林省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(No.20140414049GH)；吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No.2014Z104)

齊 玲(1974-)，女，副教授，主要從事藥物研發(fā)研究。 于洪泉(1974-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事藥物研發(fā)研究。

萬(wàn)英明(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事口腔修復(fù)和正畸研究。

R787

A

1005-9202(2016)22-5524-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.013

1 吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室 2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科