王麗麗 謝榮輝 鄔亞華 張義平 曹 俊 殷嫦嫦

(九江學院基礎醫(yī)學院，江西 九江 332000)

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藜蒿黃酮對SMMC7721生長抑制作用及其與缺氧誘導因子-1α表達的關系

王麗麗 謝榮輝1鄔亞華 張義平 曹 俊 殷嫦嫦

(九江學院基礎醫(yī)學院，江西 九江 332000)

目的 探討藜蒿黃酮對人肝癌細胞株SMMC7721的抑制作用，并觀察其與缺氧誘導因子(HIF)-1α表達的關系。方法 實驗分組：陰性對照組、槲皮素組、藜蒿黃酮組；CCK-8法檢測各組細胞的生長抑制作用；用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況；RT-PCR檢測各組HIF-1α表達。結果 與陰性對照組比較，藜蒿黃酮能明顯抑制SMMC7721細胞的生長、誘導細胞凋亡，呈時間、劑量依賴性(P<0.05)，IC50為345 μg/ml；RT-PCR結果顯示藜蒿黃酮組HIF-α表達明顯下調。結論 藜蒿黃酮能抑制SMMC7721細胞的生長、誘導其凋亡，其機制可能與HIF-1α表達下調有關。

藜蒿黃酮；SMMC7721；缺氧誘導因子；細胞凋亡

缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一〔1〕，能夠引起腫瘤細胞的一些基因表達發(fā)生改變，導致組織供血、供氧和供能的增加，促進腫瘤的生長、血管形成、轉移。而這些基因表達的改變是由缺氧誘導因子(HIF)-1α這種在缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物及人體的一種轉錄因子所調控的〔2,3〕。因此，在抗腫瘤治療及其輔助治療中，尋找HIF-1α的抑制性物質是當前研究的熱點。生長于鄱陽湖畔的藜蒿是一種草本植物，其鮮嫩莖桿和肉質莖均為本地百姓“飯桌上的寶”，藜蒿中含有黃酮化合物，研究表明植物黃酮具有多種生物活性〔4〕，如降血糖血脂、抗心律失常、抗人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)、抗自由基、抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤〔5～10〕等。我們前期研究證實：藜蒿黃酮粗提物對肝癌細胞株SMMC7721的生長有抑制作用〔11〕，為了進一步研究藜蒿黃酮對肝癌細胞的作用，我們將藜蒿黃酮粗提物進行了初步純化，將純化后的黃酮作用于SMMC7721，觀察其抑制SMMC7721作用及與HIF-1α表達的關系。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器 肝癌細胞株SMMC7721(南昌大學第一附屬醫(yī)院江西省消化疾病研究所)；人正常肝細胞L-02(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；藜蒿(采摘于鄱陽湖畔)；二甲基亞砜(DMSO)、0.25%胰蛋白酶、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(Solarbio公司)；緩沖液培養(yǎng)基(DMEM，Gbico公司)；總RNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；胎牛血清、RT-PCR試劑(TransGen公司)；流式細胞儀(BD公司)；倒置相差顯微鏡(Nikon公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱、凝膠自動成像系統(tǒng)(SIM公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，HIF-1α上游引物：5'-TGCATCTCCATCTCCTACCC-3',下游引物：5'-TGGTCAGCTGTGGTAATCCA-3'；GAPDH基因上游引物：5'-TGCATCTCCATCTCCTACCC-3',下游引物：5'-TGGTCAGCTGTGGTAATCCA-3'。

1.2 細胞增殖活力檢測(CCK-8實驗) 超聲波輔助法提取藜蒿黃酮〔12，13〕，以聚酰胺純化，并通過鹽酸-鎂粉還原反應進行鑒定后，選對數(shù)期生長的肝細胞(L-02)和肝癌SMMC7721細胞，以4 000/孔的濃度接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞貼壁且生長良好。實驗分L-02細胞和SMMC7721細胞兩部分，各分3大組：陰性對照組、陽性對照組(終濃度為400 nmol/L的槲皮素)、藜蒿黃酮組(終濃度分別為62.5、125、250、500、1 000 μg/ml)，每個濃度的藥物均設藥物空白對照孔。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，以PBS輕柔沖洗2次，每孔加入新鮮培養(yǎng)基200、10 μl CCK-8，分別培養(yǎng)2、4 h，以酶標儀檢測450 nm處吸光度值A450，以僅加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔作為空白孔進行調零，計算不同濃度藜蒿黃酮作用的增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3 細胞凋亡流式檢測 24孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)肝癌SMMC7721細胞，待生長良好后分4組：空白組、陰性對照組、陽性對照組(槲皮素組)及終濃度為345 μg/ml(即IC50濃度)的藜蒿黃酮組。于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，消化細胞，調整細胞濃度為6×105/ml，取1 ml細胞懸液1 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；加入1 ml冷PBS重懸，同上操作并重復2次；再重懸于200 μl上樣緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC,避光室溫反應15 min，加入10 μl PI和300 μl上樣緩沖液。并快速用流式細胞儀進行結果分析。在檢測時，我們將整個界面分為4個亞群：機械性損傷細胞、正常細胞、凋亡細胞和繼發(fā)性壞死細胞。

1.4 RT-PCR檢測HIF-1α 6孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)肝癌SMMC7721細胞，待生長良好后如上分四組，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，按RNA快速提取試劑盒說明提取RNA，并進行RNA純度、完整性鑒定后，逆轉錄為cDNA，再經PCR擴增(內參為GAPDH基因)。使用SIM凝膠成像系統(tǒng)掃描分析并行相關基因相對于管家基因GAPDH的相對表達率半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 細胞增殖活力檢測 利用CCK-8法檢測不同濃度(62.5、125、250、500、1 000 μg/ml)藜蒿黃酮對肝L-02細胞、肝癌SMMC7721細胞的影響，見表1，各濃度藜蒿黃酮作用下的肝L-02細胞正常生長(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義；而肝癌SMMC7721細胞增殖活性均有所降低，且隨作用濃度的增加，降低程度也有所增加，呈劑量-效應關系，500、1 000 μg/ml組與陰性對照組相比差異顯著(P<0.01)，250 μg/ml組與陰性對照組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。藜蒿黃酮作用24 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為345 μg/ml。

2.2 顯微鏡下可見 陰性對照組肝癌SMMC7721細胞生長明顯增殖;各組正常肝細胞于加藜蒿黃酮前后無變化，細胞正常生長；各濃度組肝癌細胞的生長都出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，呈濃度依賴性。500 μg/ml藜蒿黃酮在作用24 h，肝癌細胞生長出現(xiàn)明顯抑制、細胞收縮變圓，還有一些細胞裂解，48 h，多數(shù)細胞已看不見完整的結構，周圍出現(xiàn)細胞碎片；陽性對照組肝癌細胞在24 h細胞略有收縮，但不甚明顯，48 h細胞大量變圓、裂解死亡，見圖1。

2.3 藜蒿黃酮作用SMMC7721細胞24 h細胞收縮變圓，繼而細胞裂解，整個過程未出現(xiàn)細胞體積變大和溶解，據(jù)此可初步說明藜蒿黃酮可誘導SMMC7721細胞凋亡。藥物作用48 h藜蒿黃酮組(4.001)凋亡率為95.73%，陰性對照組(2.001)凋亡率為1.67%，而槲皮素組(3.001)凋亡細胞占28.37%，該結果進一步說明藜蒿黃酮有促進SMMC7721細胞凋亡的作用。

2.4 RT-PCR檢測HIF-1α 實驗各組RNA提取后，OD260/OD280為1.83，純度較好；完整性鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結果可明顯見兩條帶(28S、18S)，逆轉錄后各組PCR電泳結果如圖2。經瓊脂糖電泳后，以HIF-1α與內參的灰度比求得各組相關mRNA相對表達量，可見藜蒿黃酮組(0.052 9±0.002 9)、陽性對照組(0.134 9±0.011 5)與陰性對照組(0.214 9±0.005 4)之間差異較大(P<0.05),說明藜蒿黃酮與槲皮素對HIF-1α的表達有抑制作用?？瞻捉M為0.217 7±0.008 2。

表1 藜蒿黃酮作用L-02、SMMC7721細胞24 h CCK-8檢測吸光度(A值)比較

與陰性對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

A:24 h SMCC7721;B:48 h SMCC7721;C:24 h L-02(500 μg/ml藜蒿黃酮);D:48 h L-02(500 μg/ml藜蒿黃酮);E:24 h SMMC7721(500 μg/ml藜蒿黃酮);F：48 h SMMC7721(500 μg/ml藜蒿黃酮);G:24 h SMMC7721(400 nmol/L槲皮素);H:48 h SMMC7721(400 nmol/L槲皮素)圖1 藜蒿黃酮作用L-02、SMMC7721細胞24 h和48 h細胞形態(tài)學變化

M:Marker,1～4:藜蒿黃酮組、陽性對照組、陰性對照組、空白組圖2 RT-PCR檢測各組細胞HIF-1α mRNA表達

3 討 論

MTT法是檢測細胞增殖活性的常規(guī)方法〔14,15〕，但用該法檢測藜蒿黃酮對SMMC7721增殖活性過程中，我們發(fā)現(xiàn)：藜蒿黃酮的吸光度波長峰值與MTT檢測法的波長接近，再者MTT實驗過程要完全棄去上清液，因此無法通過增設藥物空白消除藜蒿黃酮本底的干擾，因此我們改用CCK-8法檢測細胞增殖活性，該方法通過設置藥物空白對照可消除藥物本底的干擾。因此我們認為在研究黃酮對細胞增殖活性最好選用CCK-8方法或其他可設置藥物空白實驗方法。本研究結果顯示：藜蒿黃酮能抑制肝癌SMMC7721細胞的增殖活性，呈時間、濃度依賴性，而對人正常肝細胞的生長有輕度抑制作用，但無統(tǒng)計學意義。

細胞凋亡是一種多基因嚴格控制的基本生物學現(xiàn)象，是細胞自主、有序的死亡，其常由單個細胞開始，先出現(xiàn)細胞體積的縮小、與周圍細胞分離，然后細胞質聚集、細胞膜的通透性增加，但整個過程中，細胞膜的完整性很好，其與細胞壞死是有本質的區(qū)別的。壞死是一種無序變化的死亡，主要表現(xiàn)為細胞體積脹大、細胞膜破裂、內容物外溢，引起局部嚴重的炎癥反應。本文結果可初步說明藜蒿黃酮可誘導及促進SMMC7721細胞凋亡，但僅從這兩方面還不能完全說明藜蒿黃酮誘導SMMC7721細胞凋亡,在以后的研究中,我們將進行熒光染色觀察細胞凋亡、DNA電泳、線粒體電位測定等方法進一步觀察藜蒿黃酮誘導SMMC7721細胞凋亡作用。

HIF-1是一種轉錄因子，在腫瘤組織中廣泛表達，能與缺氧反應元件結合，促進多種基因表達上調〔16〕，對維持腫瘤細胞的能量代謝、新生血管形成〔17,18〕、腫瘤侵襲和轉移起到非常重要的作用〔19,20〕。HIF-1α作為HIF-1的一個重要亞基，其突出地位無可取代。本研究說明藜蒿黃酮及槲皮素能在轉錄水平抑制肝癌細胞株SMMC7721中HIF-1α基因表達，與相關文獻報道相似〔21〕。HIF-1除了在腫瘤細胞耐受缺氧方面起重要作用外，還能調節(jié)腫瘤的凋亡〔22,23〕。有研究表明，HIF-1影響Survivin、bcl-2 mRNA及bax蛋白的表達，故推測，藜蒿黃酮可能通過抑制HIF-1α的表達，使Survivin和bcl-2 mRNA和蛋白質表達減少，而bax蛋白表達增高，進而達到抑制肝癌細胞增殖、促進其凋亡的目的。

盡管體外的細胞水平研究結果支持藜蒿黃酮具有抑制肝癌細胞增殖的作用，但其進入體內代謝后是否能保留其生物學活性，即在體內是否具有防治肝癌的作用還需通過血清藥理學及建立肝癌動物模型進行進一步的研究。

1 Jean M.How cells endure low oxygen〔J〕?Science,2004;303(2):1454-6.

2 Knocke TH,Weitmann HD,Feldmann HJ,etal.Intratumoral pO2-measurements as predictive assay in the treatment of carcinoma of the uterine cervix〔J〕.Radiother Oncol,1999;53(2):99-104.

3 Vaupel Thews O,Kelleher DK,Konerding MA.O(2)extraction is a key parameter deternining the oxygenation status of malignant tumors and normal tissues〔J〕.Int J Oncol,2003;22(4):795-8.

4 鄧丹雯，鄭功源.藜蒿的營養(yǎng)保健功能及其產品開發(fā)〔J〕.江西食品工業(yè)，2001;3(3):18-9.

5 王開金，陳列忠,李 寧,等.加拿大一枝黃花黃酮類成分及抗氧化與自由基消除活性的研究〔J〕.中國藥學雜志，2006;41(7)：493-7.

6 Samir KS,Firoj A,Takashi Ohtsuki,etal.Flavonoids from sonnemtia easeolaris〔J〕.J Nat Med,2006;60(3)：264-5.

7 黃富遠，高 明,棱云雁.黃酮類化合物的研究概況〔J〕.中華中醫(yī)藥學刊,2007;25(8):1730-2.

8 李沛波，王永剛，吳釘紅，等.田基黃中三個黃酮類化合物保肝退黃作用的實驗研究〔J〕.中山大學學報(醫(yī)學科學版)，2007;28(1)：40-3.

9 杜崇民，劉春宇.黃酮類化合物抗腫瘤研究進展〔J〕.中國野生植物資源，2007;26(3)：4-7.

10 年進興，董俊興.抗HIV活性天然黃酮類化合物研究進展〔J〕.中國藥學雜志，2005;加(8)：571-3.

11 曹 俊，周許峰，劉可越,等.藜蒿黃酮粗提物對肝癌SMMC7721細胞生長的影響〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)藥學雜志，2001;21(36):4497.

12 盛科女，王麗麗，殷嫦嫦，等超聲波輔助法提取藜蒿黃酮研究〔J〕.九江學院學報，2012;27(1):62-3.

13 賴毅勤，周宏兵.近年來黃酮類化合物提取和分離方法研究進展〔J〕.食品與藥品，2007;9(4A)：54-8.

14 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays〔J〕.J Immunol Methods,1983;65(1-2):55-63.

15 Engin Ulukaya,Mukaddes Colakogullari,Edward J.Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay〔J〕.Chemotherapy,2004;50(1):43-50.

16 Semanza GL.Hypoxia-inducible factor 1:oxygen homeostasis and disease pathophysiology〔J〕.Trends Mol Med,2001;7(8):345-50.

17 Turuo T,Naito M,Tomida A,etal.Molecular targeting therapy of cancer:drug resistance,apoptosis and survival signal〔J〕.Cancer Sci,2003;94(1):15-21.

18 Matteucci E,Modora S,Simone Metal.Hepatocyte growth factor induces apoptosis through the extrinsic pathway in hepatoma cells:favouring role of hypoxia-inducible factor-1 deficiency〔J〕.Oncogene,2003;22(26):4062-73.

19 Zhon J,Tobias S,Steffen S,etal.Tumor hypoxia and cancer progression〔J〕.Cancer Lett,2006;237(1):10-21.

20 田水剛，許 軍.缺氧誘導因子在腫瘤生長中的作用〔J〕 國外醫(yī)學外科學分冊，2005；32(2)：133-6.

21 Anastasia Triantafyllou,Ilias Mylonis,George Simos,etal.Flavonoids induce HIF-1α but impair its nuclear accumulation and activity〔J〕.Free Radical Biol Med,2008;44(4):657-70.

22 王 晗，韓忠朝.缺氧誘導因子-1與細胞凋亡〔J〕.國外醫(yī)學生理、病理科學與臨床分冊，2005;25(2)：52-5.

23 Piret TJP,Minet E,Cosse JP,etal.Hypoxia-inducible factor-l-dependent overexpression of myeloid cell factor-1 protects hypoxic cells against tert-butyl hydroperoxide:induced apotosis〔J〕.Biol Chem,2005;280(10):9336-44.

〔2015-02-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

江西省教育廳青年基金項目(GJJ10265)

殷嫦嫦(1960-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事生物化學與分子生物學研究。

王麗麗(1979-)，女，講師，碩士，主要從事生物化學與分子生物學研究。

R966

A

1005-9202(2016)22-5521-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.012

1 九江市第一人民醫(yī)院