侯正平 徐 輝 宋琳琳 侯 玥 劉安康 呂東鶴 張 麗 于 蓮 張鵬霞

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

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透明質(zhì)酸-齊墩果酸靶向給藥系統(tǒng)對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制

侯正平 徐 輝 宋琳琳1侯 玥2劉安康2呂東鶴3張 麗4于 蓮1張鵬霞

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 制備透明質(zhì)酸(HA)-齊墩果酸(OA)靶向給藥系統(tǒng)，探討其對HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用及cav-1、PI3K和AKT mRNA表達(dá)的影響。方法 采用乳化超聲法制備HA-OA靶向給藥系統(tǒng)，將其作用于HL-60細(xì)胞，CCK-8檢測HL-60細(xì)胞增殖抑制作用，采用RT-PCR方法檢測cav-1、PI3K、AKT mRNA表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)核磁、紅外檢測，成功構(gòu)建HA-OA靶向給藥系統(tǒng)。將HA-OA靶向給藥系統(tǒng)作用于HL-60細(xì)胞，HA-OA靶向給藥系統(tǒng)對HL-60細(xì)胞有抑制作用。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，HA-OA靶向給藥系統(tǒng)組增加cav-1 mRNA的表達(dá)量；降低PI3K和AKT mRNA的表達(dá)量。結(jié)論 HA-OA靶向給藥系統(tǒng)作用于HL-60細(xì)胞表面CD44，靶向給藥進(jìn)入HL-60細(xì)胞，可以通過cav-1/PI3K/AKT途徑誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。

齊墩果酸；靶向給藥系統(tǒng)；增殖抑制

天然藥物齊墩果酸(OA)對白血病HL-60細(xì)胞具有治療作用，但作用濃度高〔1～3〕。為減少OA的用量，提高其對HL-60細(xì)胞的精準(zhǔn)治療，本文合成了透明質(zhì)酸(HA)-OA靶向給藥系統(tǒng)，并檢測對HL-60細(xì)胞的生長抑制作用，探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 急性早幼粒細(xì)胞白血病系HL-60細(xì)胞株，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))購買；OA標(biāo)準(zhǔn)品(西安玉泉生物科技有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)；二甲基亞砜(Sigma公司)；PCR引物設(shè)計(jì)、合成(生工生物工程有限公司)；焦碳酸二乙酯(DEPC，大連寶生物工程有限公司)。PCR引物，cav-1：上游CCAGCTTCACCACCTTCACT，下游AGATGGAATAGACACGGCTGA，擴(kuò)增片段192 bp；磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)：上游AACAGTGCCAGACCCAAGAG，下游AAAGTGCCATCTCGCTTCC，擴(kuò)增片段455 bp；AKT：上游CCACGCTACTTCCTCCTCAA，下游GTCCATCTCCTCCTCCTCCT，擴(kuò)增片段368 bp；內(nèi)參β-actin上游TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA，下游ATCTCCTTCTGCATCCTGTC，擴(kuò)增片段251 bp。

1.2 HA-Cys的制備 采用1-乙基-3-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，修飾HA，利用NaOH將其配置成堿性溶液，室溫下避光反應(yīng)45 min，然后將L-半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)加入到反應(yīng)液中，同樣條件下反應(yīng)5 h。反應(yīng)后得到HA-Cys溶液，將其裝入透析袋中，在4℃且避光的條件下，用5 mmol/ml的鹽酸透析2次；5 mmol/ml、1%的NaCl鹽酸溶液透析2次，用1 mmol/ml的鹽酸溶液徹底透析2次，并取出透析袋中的液體，置于-80℃冰箱中預(yù)凍，隨后將其放入冷凍干燥機(jī)里凍干，獲得HA-Cys聚合物，使聚合物溶解在適量的三蒸水中，制備HA-Cys聚合物水溶液，將此水溶液加入到納米粒水混懸液中60℃攪拌1 h后，形成HA修飾的核殼納米粒。

1.3 HA-OA的制備 采用甲氧基封端的聚乙二醇和馬來酰亞胺基封端的聚乙二醇，利用聚合反應(yīng)與己內(nèi)酯(PCL)結(jié)合反應(yīng)4 h。冰水冷卻后，洗滌除去未反應(yīng)的PCL及其PCL均聚物，隨后將其純化，干燥。改變PCL與Mal-PEG和Me-PEG的質(zhì)量比,得到不同分子量的 Mal-PEG-PCL和Me-PEG-PCL共聚物。將兩者的共聚物與OA先溶解于二氯甲烷，再溶解在膽酸鈉溶液中，冰浴并利用超聲乳化法，進(jìn)行Hitrap脫鹽柱純化法，用PBS收集純化后的產(chǎn)物，并向其中加入修飾過的HA-Cys，兩者避光反應(yīng)，充入氮?dú)? h，制備HA-OA靶向給藥系統(tǒng)。

1.4 HA-OA靶向給藥系統(tǒng)對HL-60細(xì)胞的抑制作用 配制細(xì)胞懸液，取96孔板，設(shè)為空白對照組、OA組和HA-OA組，每孔10萬個細(xì)胞。用藥組分為100、80、60 μmol/L組，每組設(shè)5個孔，對照組補(bǔ)加10 μl無血清培養(yǎng)液。將96孔板每孔細(xì)胞懸液混勻，放入5%CO2培養(yǎng)箱37℃ 培養(yǎng)24 h。24 h后取出96孔板，每孔加10 μl膽率收縮素八肽(CCK-8)溶液混勻，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀450 nm檢測。

1.5 HA-OA靶向給藥系統(tǒng)對HL-60細(xì)胞基因表達(dá)的影響 選用80 μmol/L的HA-OA靶向給藥系統(tǒng)對HL-60細(xì)胞進(jìn)行處理。采用RT-PCR檢測cav-1、PI3K和AKT mRNA表達(dá)。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s；53～55℃ 30 s；72℃ 30 s～1 min；35～40個循環(huán)；72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外成像系統(tǒng)分析，以與內(nèi)參照基因 β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值之比表示mRNA表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件，多組間比較采用方差分析；兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HA-OA納米粒的成功制備 運(yùn)用1H-NMR圖譜進(jìn)行分析，在1.5 PPM處出現(xiàn)的信號峰表示Cys分子亞甲基上的氧原子，結(jié)果表明HA與Cys以共價的形式連接在一起。說明通過EDAC/NHS修飾的HA-Cys已成功制備。經(jīng)紅外光譜檢測，在1 722 cm處以及2 943 cm增加了羥基的峰和己內(nèi)酯的脂肪碳?xì)涞纳炜s振動峰,2 881 cm處峰的強(qiáng)度減弱,標(biāo)志著聚乙二醇-己內(nèi)酯嵌段聚合物的形成。說明通過mPEG-PCL/Mal-PEG-PCL修飾的OA與HA有效的結(jié)合，成功制備了HA-OA納米粒。見圖1，2。

2.2 CCK-8檢測HA-OA納米粒對HL-60細(xì)胞的抑制作用 空白對照組對 HL-60 細(xì)胞的存活率并無明顯影響；OA組對HL-60細(xì)胞有抑制作用；HA-OA組使HL-60細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.01)。OA組與HA-OA組相比，HA-OA組對HL-60細(xì)胞的抑制效果明顯高于OA組。隨著HA-OA納米粒濃度的升高，對 HL-60細(xì)胞抑制作用也增強(qiáng)。見表1。

圖1 1H-NMR圖譜檢測疏基化HA

圖2 紅外光譜檢測聚乙二醇-己內(nèi)酯嵌段聚合物

濃度(μmol/L)OA組HA?OA組0100±229100±017606450±3711)5324±0491)806246±1821)5092±1362)1005963±2281)4934±0592)

與0 μmol/L組相比：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 HA-OA靶向給藥系統(tǒng)對HL-60細(xì)胞的基因表達(dá)的檢測 與空白對照組和OA組比較，HA-OA組降低HL-60細(xì)胞PI3K、AKT mRNA 的表達(dá)量；HA-OA增加HL-60細(xì)胞cav-1 mRNA的表達(dá)量。見表2，圖3～圖5。

表2 HA-OA對HL-60細(xì)胞cav-1、PI3K和AKT mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組相比：1)P<0.05

圖3 HA-OA對HL-60細(xì)胞PI3K mRNA表達(dá)的影響

圖4 HA-OA對HL-60細(xì)胞AKT mRNA表達(dá)的影響

圖5 HA-OA對HL-60細(xì)胞cav-1 mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

腫瘤靶向治療已經(jīng)成為臨床腫瘤治療的主要方法之一〔4〕。急性髓系白血病(AML)約占急性白血病的15%～20%〔5〕，HL-60細(xì)胞是AML中最常見的一種，OA能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，但由于OA為脂溶性，需要DMSO為溶劑溶解，有一定毒性，損害正常細(xì)胞。為使藥物靶向作用HL-60細(xì)胞，利用HL-60細(xì)胞表明的跨膜糖蛋白CD44，可與其配體HA結(jié)合的特點(diǎn)。HA由美國的兩位教授首次在牛眼的玻璃體中所提取〔6〕，作為載體，HA可以加強(qiáng)藥物的親水性，增加藥物的穩(wěn)定性，還可以延長藥物在體內(nèi)的存留時間，提高有效的作用濃度。HA還具有腫瘤的靶向性，這在腫瘤治療新型給藥系統(tǒng)中奠定了基礎(chǔ)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)將HA通過EDAC/NHS修飾后，制備了疏基化HA。將OA經(jīng)過mPEG-PCL/Mal-PEG-PCL修飾之后，通過超聲乳化法，將HA-Cys與OA結(jié)合，制備HA-OA靶向給藥系統(tǒng)。HA-OA靶向給藥系統(tǒng)作用于HL-60細(xì)胞，由于巰基化聚合物可以使藥物黏附在腸道黏膜的表面，抑制藥物與腸道蛋白酶的接觸，從而抑制了藥物的降解，將巰基化聚合物作為載體，它可以提高黏液層藥物濃度，使藥物發(fā)揮有效作用濃度，從而增強(qiáng)藥物的作用〔8〕。目前，cav-1在腫瘤細(xì)胞的信號通路中逐漸成為一個新的研究熱點(diǎn)，它是信號通路交聯(lián)的中心，曾被認(rèn)為是“廣譜”激酶抑制劑〔9〕。PI3K/Akt是cav-1下游的一條信號通路，也是蛋白酪氨酸激酶(PTKs)主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，cav-1與神經(jīng)酰胺形成復(fù)合物,抑制PI3K/Akt通路，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本結(jié)果推測HA-OA通過增加cav-1 mRNA的表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號通路，減少HL-60細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致HL-60細(xì)胞凋亡。

1 Ma W,Wang DD,Li L,etal.Caveolin-1 plays a key role in Oleanolic acid-induced apoptosis of HL-60 cells〔J〕.Oncol Repor,2014;32(1):293-301.

2 馬 微，王迪迪，王 昭,等.慢病毒介導(dǎo)的CAV1過表達(dá)對HL-60細(xì)胞增殖與凋亡的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013；21(4)：905-10.

3 王迪迪，葛堂棟，楊 玉，等.Ly294002對人白血病HL-60細(xì)胞的體外抑制作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013;33(22)：5617-9.

4 張會鮮,何琪楊.基于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的抗腫瘤靶向藥物敏感性預(yù)測及其研發(fā)應(yīng)用〔J〕.中國新藥雜志,2015;24(16):1820-4.

5 張之南.血液病學(xué)〔M〕.第2版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2005:138-940.

6 王天琪,張 娜.透明質(zhì)酸在腫瘤治療中的應(yīng)用〔J〕.生命的化學(xué),2014;34(5):690-5.

7 邱麗筠,黃麗麗,俞淑文.透明質(zhì)酸在腫瘤治療藥物新型給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用〔J〕.中國實(shí)用醫(yī)藥,2014;9(16):238-41.

8 黃愛文,趙佳麗,劉志宏,等.胰島素巰基化透明質(zhì)酸納米粒的制備與體外性質(zhì)評價〔J〕.中國生化藥物雜志,2014;35(34):77-80.

9 Yan SL,Huang CY,Wu ST,etal.Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in four human liver cancer cell lines〔J〕.Toxicol In Vitro,2010;24(3):842-8.

〔2016-07-05修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81274101；81070428);佳木斯大學(xué)校級交叉學(xué)科研究項(xiàng)目(jc2014-001)；佳木斯大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(cxtd-2016-03);佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(LZZ2015-008;LZZ2015-009);國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410222006，201510222002，201610222007)

于 蓮(1960-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物靶向治療研究。 張鵬霞(1967-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事白血病發(fā)病機(jī)制與靶向治療研究。

侯正平(1989-)，男，在讀碩士，主要從事白血病發(fā)病機(jī)制與靶向治療研究。

R733.7；R944.1

A

1005-9202(2016)22-5510-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.007

1 佳木斯大學(xué)藥學(xué)院 2 佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)卓越醫(yī)師班學(xué)生

3 佳木斯大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院2014級本科生

4 佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院