任真奎 楊 梅 官志忠 禹文峰

(貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

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PNU上調(diào)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性Cryab抑制Aβ聚集

任真奎 楊 梅 官志忠 禹文峰

(貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

目的 探討PNU激活星形膠質(zhì)細(xì)胞α7膽堿能受體(α7 nAChRs)上調(diào)內(nèi)源性B-晶狀體蛋白(Cryab)并抑制β淀粉樣蛋白(Aβ)集聚的現(xiàn)象及其機(jī)制。方法 分離24 h內(nèi)新生乳鼠大腦皮質(zhì)培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞并鑒定；體外制備Aβ1～42寡聚體；將細(xì)胞分為對照組、PNU組、PNU+α7 nAChRs阻斷劑(MLA)組、Aβ1～42組、PNU+ Aβ1～42組、PI3K信號通路阻斷劑LY294002+PNU+ Aβ1～42組。用蛋白印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)Cryab、P-Akt(ser473)、Aβ寡聚體的表達(dá)水平。結(jié)果 (1)PNU可以顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性Cryab蛋白(P<0.05)；應(yīng)用MLA阻斷α7 nAChRs后，PNU上調(diào)內(nèi)源性Cryab蛋白的作用被顯著抑制(P<0.05)；使用LY294002阻斷PI3K信號通路后，PNU上調(diào)內(nèi)源性Cryab蛋白的作用被顯著抑制(P<0.01)；(2)PNU能夠顯著上調(diào)磷酸化Akt蛋白水平(P<0.05)；應(yīng)用MLA阻斷α7 nAChRs后，PNU上調(diào)磷酸化Akt蛋白的作用被顯著抑制(P<0.01)；使用LY294002阻斷PI3K信號通路后，PNU上調(diào)磷酸化Akt蛋白的作用被顯著抑制(P<0.01)；(3)在細(xì)胞裂解液及培養(yǎng)基中，PNU顯著增強星形膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ聚集的抑制作用(P<0.01)；使用LY294002阻斷PI3K信號通路后，PNU增強星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制Aβ聚集的功能顯著減弱(P<0.01)。結(jié)論 PNU通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞α7 nAChRs上調(diào)內(nèi)源性Cryab從而抑制Aβ集聚；PI3K/Akt信號通路可能參與PNU激活星形膠質(zhì)細(xì)胞α7 nAChRs上調(diào)內(nèi)源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的過程。

星形膠質(zhì)細(xì)胞；阿爾茨海默病；α7膽堿能受體；PNU；B-晶狀體蛋白；β淀粉樣蛋白

β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集是阿爾茨海默病(AD)核心發(fā)病機(jī)制，Aβ的聚集不僅可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，也可以破壞突觸結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致記憶和認(rèn)知功能障礙〔1〕。Aβ的聚集能夠激活星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、炎性因子從而導(dǎo)致腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥〔2〕。

α7膽堿能受體(α7 nAChRs)廣泛分布于大腦皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞〔3〕。在 AD 的發(fā)病機(jī)制中，α7 nAChRs通過與Aβ相互作用而扮演了重要的病理角色〔4〕。近年來的研究表明，α7 nAChRs可能是拮抗Aβ神經(jīng)毒性的一個重要靶點〔5〕。B-晶狀體蛋白(Cryab)在大腦內(nèi)具有許多重要的生理功能：抗炎、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等〔6〕。在AD大腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的Cryab蛋白明顯上調(diào)，并且這些上調(diào)的Cryab蛋白緊密地分布在Aβ蛋白沉積周圍〔7〕。Cryab蛋白能夠通過與Aβ蛋白直接結(jié)合等方式有效地阻止Aβ蛋白的聚集及其細(xì)胞毒性作用〔8〕。

PNU是α7 nAchR激動劑中特異性較高的合成物，與其他nAchR亞單位結(jié)合微乎其微，與α7 nAChR結(jié)合，提高和改善AD動物模型的認(rèn)知和記憶功能〔9〕。PNU通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞α7 nAChR提高細(xì)胞的存活與抗凋亡〔10〕，但在星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中，PNU是否能增強星形膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ聚集的抑制及其機(jī)制尚不清楚。

我們前期研究結(jié)果證實，用PNU激活星形膠質(zhì)細(xì)胞a7 nAChRs能夠顯著增強星形膠質(zhì)細(xì)胞對 Aβ聚集的抑制，但具體調(diào)控機(jī)制不清楚。基于Cryab蛋白的特性，推測星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性Cryab蛋白可能是PNU介導(dǎo)Aβ聚集的中間環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司(美國)；Aβ1～42肽、六氟異丙醇、二甲基亞砜(DMSO)、PNU、methyllycaconitine (MLA) 購于Sigma公司(美國)；青-鏈霉素及胰蛋白酶購于Hyclone公司(美國)；6E10抗體購自BioLegend公司(美國)；鼠抗Cryab(αB-crystallin)單克隆抗體購自Abcam公司(美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗；鼠抗β-肌動蛋白(β-actin) 單克隆抗體；磷脂酰肌醇子-激酶- 蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的抑制劑LY294002及相關(guān)位點的抗體購于CST公司(美國)；抗體稀釋液、封閉液、聚丙烯酰胺凝膠購自碧云天公司；高效顯影膠片、顯影液、定影液購自柯達(dá)公司；電化學(xué)增強發(fā)生法(ECL-Plus)試劑及聚乙烯二氟(PVDF)膜購于Millipore公司(美國)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司(美國)；倒置顯微鏡(Olympus)；-80℃冰箱(美國Thermo公司)；高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；ELX 800酶標(biāo)儀 (美國 Bio-tec公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)。

1.2 Aβ1～42寡聚體的制備 參照Klein〔11〕體外制備Aβ1～42寡聚體的方法，將預(yù)冷的六氟異丙醇(HFIP)加入Aβ1～42粉末中，使其充分溶解后常溫孵育60 min。隨后為使HFIP揮發(fā)完全，將其放在常溫下通風(fēng)櫥過夜。將干燥的肽膜于-80℃保存，使用時取出用DMSO溶解，再用含十二烷基硫酸鈉(SDS)的硝酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，4℃存放2 w，冰凍高速離心(10 min、14 000 g/min)，上清液即為寡聚體。

1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)傳代及鑒定 參照McCarthy等〔12,13〕的方法并改進(jìn)，取24～48 h內(nèi)新生SD乳鼠的大腦皮質(zhì)(貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，動物合格證號：SCXK(黔)2012-0001，將其大腦皮質(zhì)剪成泥狀，消化漂洗后，加入含1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)、10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，吹打成細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶，5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)。24 h后換液，之后每3天換1次液直至細(xì)胞鋪滿瓶底。培養(yǎng)8～9 d，純化并傳3～4代。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)細(xì)胞免疫熒光法對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行染色，鑒定細(xì)胞純度。

1.4 分組及細(xì)胞處理 將培養(yǎng)好的星形膠質(zhì)細(xì)胞純化、傳代并鑒定后，以5×105的密度種入六孔板內(nèi)。將細(xì)胞分為對照組、PNU組、PNU+MLA組、Aβ1～42組、PNU+ Aβ1～42組、PNU+ LY294002+ Aβ1～42組。PNU+MLA組預(yù)先加入MLA處理2 h，隨后加入PNU；PNU+ LY294002+ Aβ1～42組，預(yù)先加入LY294002處理2 h，隨后加入PNU孵育18 h，換液后，用DMEM培養(yǎng)基吹洗3次，加入終濃度為1 μmol/L的Aβ1～42寡聚體繼續(xù)在37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.5 蛋白印跡法 從六孔板中收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(100 μl/孔)，4℃、12 000 r/min離心20 min后取上清，將提取的蛋白質(zhì)用BCA蛋白定量試劑盒定量后分裝保存(-80℃)，用Western印跡方法檢測Cryab、P-Akt(ser473)及Aβ蛋白表達(dá)水平。12%的梯度膠電泳，蛋白樣品分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%胎牛血清(BSA)室溫封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)漂洗(3次×10 min)，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，TBS-T漂洗(3次×10 min)后加入HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBS-T漂洗(3次×10 min)后曝光。用ImageJ軟件分析曝光結(jié)果，以β-actin為內(nèi)對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用one-way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 PNU顯著增強星形膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ聚集的抑制作用 在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)模型上，用α7 nAChRs 激動劑PNU處理細(xì)胞，能夠顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)(Aβ1～42組86.22±8.56，PNU+Aβ1～42組53.13±11.56)和細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)(Aβ1～42組100.74±3.98，PNU+Aβ1～42組54.63±13.58)Aβ聚集的抑制作用,見圖1。

圖1 PNU增強星形膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ聚集的抑制作用

2.2 PNU顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性Cryab蛋白表達(dá)水平 課題組前期結(jié)果顯示，PNU以5 μmol/L刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后對Cryab蛋白的上調(diào)作用最為明顯。以5 μmol/L PNU處理星形膠質(zhì)細(xì)胞在不同的時間段(6，12，18，24 h)，對Cryab蛋白的上調(diào)效應(yīng)表現(xiàn)出時間依賴性，0、6、12、18、24 h Cryab蛋白表達(dá)量分別為102.71±13.08，223.99±25.32，336.57±60.78，427.32±26.73，340.65±55.40，18 h達(dá)到穩(wěn)定階段，選擇該時間、濃度(18 h、5 μmol/L)作為后繼研究。PNU刺激后 Cryab的表達(dá)量升高。見圖2。

2.3 PNU通過激活α7 nAChRs而上調(diào)Cryab蛋白水平 PNU刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后α7nAChRs的表達(dá)上調(diào)。本研究選取α7nAChRs的特異性阻斷劑 MLA，以50、100、150 nmol/L MLA預(yù)先處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h后，再加入5 μmol/L PNU共同孵育18 h。不加PNU、MLA時Cryab蛋白表達(dá)量為95.54±9.14；加PNU 5 μmol/L及0、50、100、150 nmol/L MLA后Cryab蛋白表達(dá)量依次為128.92±15.65，81.01±20.15，75.71±3.03，84.28±6.63。MLA刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后PNU上調(diào)內(nèi)源性 Cryab的效應(yīng)受到抑制。見圖3。

圖2 PNU上調(diào)內(nèi)源性Cryab蛋白

圖3 PNU通過激活α7 nAChRs而上調(diào)內(nèi)源性Cryab蛋白

2.4 PI3K/Akt信號通路參與PNU激活α7 nAChRs上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性Cryab蛋白 不加PNU，P-Akt蛋白表達(dá)量為93.67±3.84。以5 μmol/L PNU處理星形膠質(zhì)細(xì)胞在不同時間段(5，10，20，30 min)，對P-Akt(ser473)蛋白的上調(diào)效應(yīng)表現(xiàn)出時間依賴性并且20 min達(dá)到穩(wěn)定階段，0、10、20、30 min時P-Akt蛋白表達(dá)量分別為110.66±9.80，97.55±17.93，132.98±13.23，138.40±24.292 0 min被選擇作為后繼實驗。該上調(diào)作用被PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002或α7 nAChRs的阻斷劑MLA抑制。不加PNU、LY294002時，P-Akt表達(dá)量為98.08±5.61，僅加PNU 5 μmol/L時P-Akt表達(dá)量為143.99±6.64，PNU及LY294002共同作用時，P-Akt表達(dá)量為57.85±8.930。不加PNU、MLA時，P-Akt表達(dá)量為98.10±6.34，僅加PNU時，P-Akt表達(dá)量為144.03±14.53；PNU及MLA共同作用時，P-Akt表達(dá)量為75.20±12.96。見圖4，圖5。

不加PNU、LY294002時，Cyab表達(dá)量為91.72±7.27；僅予PNU時為Cryab表達(dá)量為134.29±20.74，LY294002預(yù)先處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h，再加入PNU共同孵育18 h，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性Cryab的表達(dá)受到抑制(93.40±16.30)。見圖6。

圖4 PNU上調(diào)P-Akt(ser473)蛋白表達(dá)

圖5 LY294002或MLA能抑制P-Akt(ser473)蛋白表達(dá)

圖6 LY294002能抑制內(nèi)源性Cryab蛋白表達(dá)

2.5 PNU顯著增強星形膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ聚集的抑制作用與PI3K/Akt信號通路的激活相關(guān) 與Aβ1～42組相比，PNU+ Aβ1～42組的Aβ蛋白顯著下調(diào)(P<0.01)；與PNU+ Aβ1～42組相比，PNU+ Aβ1～42+ LY294002組的Aβ蛋白顯著上調(diào)(P<0.01)。說明PNU激活α7 nAChRs之后，通過PI3K/Akt信號通路上調(diào)Cryab，從而抑制Aβ的集聚。見表1，圖7。

表1 LY294002處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后Aβ寡聚體表達(dá)的檢測

與Aβ1～42組相比:1)P<0.01；與PNU+ Aβ1～42組相比:2)P<0.01

圖7 PNU通過激活PI3K/Akt信號通路而抑制β-淀粉樣蛋白的集聚

3 討 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多而且參與重要的生理功能：防止神經(jīng)元損傷、提供代謝、營養(yǎng)支持和調(diào)節(jié)突觸活動〔14〕。星形膠質(zhì)細(xì)胞在Aβ聚集和沉積過程中具有雙重病理角色。一方面，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過大量分泌細(xì)胞因子，炎性因子和一氧化氮等神經(jīng)毒性物質(zhì)而導(dǎo)致AD腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥發(fā)生〔15〕；另一方面，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞也能夠表達(dá)與Aβ降解有關(guān)的酶，對Aβ進(jìn)行有效地吞噬和降解〔16〕。基于以上事實，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ聚集和沉積的抑制功能可能成為治療 AD 的一個重要方向。

α7膽堿能受體是配體門控離子通道家族中的成員。它由五個跨膜亞基組成，有一個大的胞外氨基端，4個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞質(zhì)域〔17，18〕。α7 nAChRs廣泛分布于大腦皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞〔3〕。在 AD 的發(fā)病機(jī)制中，α7 nAChRs 通過與Aβ的相互作用而扮演了重要的病理角色〔4〕。近年來的研究表明，α7 nAChRs可能是拮抗Aβ神經(jīng)毒性的一個重要靶點。在神經(jīng)元細(xì)胞中，α7nAChRs能夠通過激活多條細(xì)胞內(nèi)信號通路而拮抗 Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔19〕。在前期結(jié)果中，用PNU處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)α7 nAChRs的表達(dá)上調(diào)，并且能顯著抑制Aβ聚集。本研究發(fā)現(xiàn)PNU通過激活α7nAChRs而上調(diào)Cryab蛋白水平，由此可推測PNU是通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的α7 nAChRs后上調(diào)內(nèi)源性Cryab從而抑制Aβ的聚集。

PI3K/AKT 信號通路參與了α7 nAChRs的神經(jīng)保護(hù)功能，在AD研究中發(fā)現(xiàn)，Akt在海馬神經(jīng)元中表達(dá)減少，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡〔20〕。本實驗結(jié)果說明PNU激活α7 nAChRs后，使PI3K/Akt信號通路激活引起細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的效應(yīng)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)LY294002能抑制PNU上調(diào)內(nèi)源性Cryab蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明，PNU通過α7 nAChRs上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性Cryab蛋白與PI3K/Akt信號通路的激活相關(guān)。上調(diào)Akt能對抗Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和tau蛋白磷酸化〔21〕。PNU處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后能明顯抑制Aβ的聚集，并且該作用能被LY294002阻斷，說明PNU通過α7 nAChRs抑制Aβ聚集與PI3K/Akt信號通路的激活相關(guān)，而且該過程可能有內(nèi)源性Cryab蛋白的參與。因為在AD大腦中，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的Cryab蛋白明顯上調(diào)，并且這些上調(diào)的Cryab蛋白緊密地分布在Aβ蛋白沉積周圍〔7〕。Cryab蛋白能夠通過與Aβ蛋白直接結(jié)合等方式有效地阻止Aβ蛋白的聚集及其細(xì)胞毒性作用〔8〕。

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〔2016-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

PNU inhibiting Aβ aggregation via upregulation endogenous Cryab in rat astrocytes

REN Zhen-Kui,YANG Mei,GUAN Zhi-Zhong,et al.

Key Lab of Medical Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,China

Objective To investigate the possible mechanism of PNU on amyloid β (Aβ)aggregation via activation α7 nAChRs as well as upregulation endogenous Cryab.Methods Primary culture astrocytes were separated from neonatal SD rat cerebral cortex;Aβ1-42oligomers were prepared in vitro.Astrocytes were divided into control,PNU,MLA,Aβ1-42,PNU + Aβ1-42,PNU + LY294002 + Aβ1-42groups.The protein levels of Cryab,phosphorylated-Akt (ser473)and Aβ oligomers in the cells were detected by Western blot.Results (1)PNU significantly increased endogenous Cryab in astrocytes(P<0.05).The effect of upregulation endogenous Cryab by PNU was significantly inhibited by α7 nAChR antagonist-MLA (P<0.05).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of upregulation endogenous Cryab by PNU was significantly inhibited(P<0.01).(2)PNU significantly increased phosphorylated-Akt in astrocytes (P<0.05).The effect of up regulation phosphorylated-Akt by PNU was significantly inhibited by α7 nAChR antagonist-MLA(P<0.01).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of upregulation phosphorylated-Akt by PNU was significantly inhibited (P<0.01).(3)In cell lysis solution and medium,PNU significantly enhanced astrocyte to inhibit Aβ aggregation (P<0.01).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of inhibition Aβ aggregation by PNU was significantly inhibited(P<0.01).Conclusions PNU could significantly inhibit Aβ aggregation via activated α7 nAChRs as well as upregulation endogenous Cryab in astrocytes.PI3K/Akt signaling pathway is likely to be invoved in this process.

Astrocytes;Alzheimer’s disease;α7nAChRs;PNU;αB-crystallin;β-amyloid

國家自然科學(xué)基金(81360199)；教育部科學(xué)技術(shù)研究項目(213032A)；貴州省國際科技合作計劃項目(黔科合外G字〔2013〕7026號)；貴州省教育廳項目(2015年貴州省普通高等學(xué)校地方病和少數(shù)民族疾病防控創(chuàng)新團(tuán)隊)

禹文峰(1971-)，男，教授，主要從事神經(jīng)分子生物學(xué)研究。

任真奎(1988-)，男，碩士，主要從事神經(jīng)分子生物學(xué)研究。

R34

A

1005-9202(2016)22-5506-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.006