張麗勇 曹紅十

(白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生理教研室，吉林 白城 137000)

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S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白在原發(fā)性腦干損傷后的表達

張麗勇 曹紅十1

(白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室，吉林 白城 137000)

目的 探討原發(fā)性腦干損傷后腦干組織中S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達規(guī)律。方法 56只SD大鼠中隨機取7只作對照組，其余49只采用機械撞擊法建立大鼠原發(fā)性腦干損傷模型，7只大鼠擊打30 min內(nèi)死亡，記為擊打后30 min組；存活的42只大鼠隨機分為6組，每組7只，分別于擊打后2、6、12、24、48、72 h斷髓處死。采用Gless嗜銀染色，SP免疫組化法觀察并測定不同損傷時間大鼠腦干組織中S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達情況。結(jié)果 S100B蛋白表達量從腦干損傷后30 min開始增加，隨時間延伸逐漸升高，損傷后24 h達到峰值并開始下降，損傷后72 h基本恢復(fù)至正常水平并與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白量從腦干損傷后30 min開始增加，損傷后48 h達到峰值并開始下降，但損傷后72 h仍高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 原發(fā)性腦干損傷后S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達具有明顯規(guī)律性，在起病時間的推斷和神經(jīng)修復(fù)過程中具有重要意義。

腦干損傷；S100B蛋白；膠質(zhì)纖維酸性蛋白

腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細胞常出現(xiàn)增生，這是退行性病變及中樞神經(jīng)損傷引發(fā)神經(jīng)組織變化的主要表現(xiàn)。S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白是兩種主要的神經(jīng)膠質(zhì)細胞標記蛋白〔1〕，研究其在腦干損傷后不同時間的變化規(guī)律有助于較精準地推斷原發(fā)性腦干損傷患者的發(fā)病時間，采取有針對性的治療方案從而改善預(yù)后。本次研究通過檢測損傷后不同時間段大鼠腦干組織中S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達情況，分析其在原發(fā)性腦干損傷中的作用機制及變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 SPF級SD大鼠56只，體質(zhì)量(200±20)g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司。SP免疫組化檢測試劑盒、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白多克隆抗體、DAB顯色試劑盒均購于上海研卉生物科技有限公司；大鼠抗S100B蛋白多克隆抗體購于上海瑞齊生物科技有限公司。

1.2 模型建立及分組 隨機取7只大鼠作對照組，其余49只大鼠建立原發(fā)性腦干損傷模型。撞擊裝置為自行設(shè)計，在鐵支架上固定一根內(nèi)徑為1.5 cm的光滑導(dǎo)管，支架底座固定一木板，前端垂直放置一個小擋板，調(diào)整導(dǎo)管角度使其與底座之間呈45°夾角。大鼠按300 mg/kg腹腔注射100 g/L的水合氯醛麻醉，清除頭顱表面皮毛后暴露顱骨，大鼠在底座上取俯臥位，將導(dǎo)管對準枕骨粗隆段，擊打裝置從導(dǎo)管遠端自由下滑對枕部進行打擊，每只大鼠擊打1次，造成原發(fā)性腦干損傷。7只大鼠擊打30 min內(nèi)死亡，記為擊打后30 min組；存活的42只大鼠采用隨機數(shù)字法分為6組，每組7只，分別于擊打后2、6、12、24、48、72 h斷髓處死；對照組大鼠直接斷髓處死。

1.3 標本采集和檢測 大鼠處死后立即開顱取腦干組織，在4%多聚甲醛溶液中固定1 d。沿正中線將腦干組織切開，將橫切面作為包埋面常規(guī)組織脫水，石蠟包埋后3 μm連續(xù)切片，分別行Gless嗜銀染色和免疫組化染色。使用Motic數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)，顯微鏡放大400倍，隨機取7個視野，對免疫組化陽性細胞進一步測定S100B蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件行方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠臨床癥狀觀察 實驗組大鼠受打擊后即刻出現(xiàn)昏迷、呼吸急促、角膜反射消失等體征。擊打后30 min組大鼠在受打擊后出現(xiàn)心律不齊、呼吸不規(guī)律，20～30 min心臟搏動停止。傷后存活大鼠在受打擊后15～20 min呼吸和心臟搏動基本恢復(fù)到正常水平，約60 min后蘇醒，生命體征平穩(wěn)。腦干損傷大鼠均可見腦干水腫，明顯的蛛網(wǎng)膜下腔出血，后30 min組出血部位較多。

2.2 Gless嗜銀染色 對照組大鼠腦干組織軸索走行、排列規(guī)律，間隙均勻分布。擊打后30 min組大鼠呈彌散性分布的軸索扭曲、腫脹，間隙寬度明顯增加、末端腫大。擊打后2、6 h組大鼠腦干中以軸索扭曲、腫脹為主要特征的變化更明顯；擊打后12 h組大鼠可見軸漿從軸索中流出，進入腦干組織局部產(chǎn)生的軸索收索球，見圖1；擊打后24 h大鼠腦干組織中可見軸索收索球體積和數(shù)量增加；擊打后48、72 h組大鼠腦干組織中軸索腫脹程度明顯減輕。

圖1 大鼠腦干損傷12 h后形成的軸索收索球(Gless嗜銀染色，×400)

2.3 各組S100B蛋白表達情況 對照組大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞突起和胞體中均勻分布S100B陽性細胞；S100B蛋白表達量為79.93±0.82。擊打后30 min組大鼠細胞結(jié)構(gòu)破壞，突起消失；S100B蛋白表達量為85.04±0.76，明顯高于對照組(P<0.01)。之后大鼠腦干組織S100B蛋白表達隨著擊打后時間的延伸逐漸升高，于擊打后24 h達到峰值98.53±0.81，明顯高于對照組(P<0.01)。擊打后48 h大鼠腦干組織S100B蛋白表達量87.84±1.07，與擊打后24 h相比有所降低，但仍明顯高于對照組(P<0.01)。擊打后72 h大鼠腦干組織S100B蛋白表達量80.03±0.95，與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，細胞體積逐漸增大到正常范圍，可見細胞核。見圖2。

2.4 各組膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達情況 對照組大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞突起和胞體中分布膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性細胞，胞體較小，突起細長，膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達量為31.62±0.57。擊打后30 min組大鼠部分細胞形態(tài)不規(guī)則，見圖3，膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達量為36.11±0.54，明顯高于對照組(P<0.01)。擊打后2 h組大鼠細胞突起染色加深，膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達量為37.94±0.68，明顯高于對照組(P<0.01)。隨時間延長其表達量逐漸上升，擊打后48 h達到峰值47.30±0.65，明顯高于對照組(P<0.01)，細胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)顏色加深，突起增多。擊打后72 h膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達量為45.73±0.39，仍明顯高于對照組(P<0.05)。

圖2 大鼠腦干組織中S100B蛋白表達情況(DAB，×400)

圖3 大鼠腦干組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達情況(DAB，×400)

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細胞是數(shù)量最多的支持細胞，在日常神經(jīng)生理活動、神經(jīng)組織再生及免疫、多種神經(jīng)疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用〔2〕。S100B是一類低分子量的鈣離子結(jié)合蛋白，主要由星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞分泌，具有多種活性，可作為星形膠質(zhì)細胞激活的重要標志物，能夠提升神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中Ca2+濃度〔3〕。相關(guān)研究顯示，S100B蛋白可經(jīng)類似旁分泌作用促進神經(jīng)生長；在損傷反應(yīng)中表達量明顯提升，與損失時間及程度呈相關(guān)性〔4〕。膠質(zhì)纖維酸性蛋白是一種中間絲狀蛋白，由星形膠質(zhì)細胞特異性表達，可作為星形膠質(zhì)細胞和其癌變的特異性標志物〔5〕。細胞數(shù)量、體積及分支增加，膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達提升是星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)的標志〔6〕，因此其增殖水平及腦干損傷后病變程度能夠用膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達水平來評價。

本研究顯示，大鼠腦干損傷后30 min內(nèi)，S100B蛋白與膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達量開始增加，此時表達量增加可能為星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性肥大而非增生，撞擊損傷了大鼠腦干神經(jīng)的星狀膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)，S100B蛋白與膠質(zhì)纖維酸性蛋白從胞內(nèi)漏出而導(dǎo)致表達量上升。隨著時間延伸，腦干損傷反應(yīng)程度不斷提升，到24～48 h達到損傷反應(yīng)的峰值，之后神經(jīng)膠質(zhì)細胞自我修復(fù)和再生能力不斷加強，相應(yīng)的損傷反應(yīng)逐漸減弱，S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達量下降，直至修復(fù)完成。綜上所述，原發(fā)性腦干損傷后S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達隨時間呈明顯變化規(guī)律，以上兩項指標聯(lián)合分析有助于判斷患者腦干損傷較為精確的時間，采取有針對性的治療方案，改善治療預(yù)后。

1 Yan H，Zhang HW，Wu QL,etal.Increased leakage of brain antigens after traumatic brain injury and effect of immune tolerance induced by cells on traumatic brain injury〔J〕.Chin Med J，2012；125(9)：1618-26.

2 劉 濤，何曉光，劉佰運，等.326例急性閉合性重型顱腦創(chuàng)傷早期死亡分析〔J〕.中華神經(jīng)外科雜志，2010；26(8)：731-3.

3 Cheng TY，Chen MH，Chang WH，etal.Neural stem cells encapsulated in a functionalized self-assembling peptide hydrogel for brain tissue engineering〔J〕.Biomaterials，2013；34(8)：2005-16.

4 Guan J，Zhu Z，Zhao RC，etal.Transplantation of human mesenchymal stem cells loaded on collagen scaffolds for the treatment of traumatic brain injury in rats〔J〕.Biomaterials，2013；34(24)：5937-46.

5 黃效東.奧拉西坦治療老年重型顱腦損傷患者的療效〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(10)：2159-60.

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〔2016-04-18修回〕

(編輯 郭 菁)

吉林省教育廳“十二五”科技研究項目(2013336)

曹紅十(1977-)，女，副主任護師，主要從事臨床護理藥理學(xué)研究。

張麗勇(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事臨床生理學(xué)研究。

R651.1

A

1005-9202(2016)22-5504-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.005

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院