王 彌 封桂英 宋鴻儒 邢恩鴻 郭亞春 安 高 趙曉菲

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

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膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠Th17細(xì)胞及相關(guān)信號蛋白的動態(tài)變化

王 彌 封桂英 宋鴻儒 邢恩鴻1郭亞春 安 高 趙曉菲

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的 研究雞Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠淋巴細(xì)胞Th17及其轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3和細(xì)胞因子信號蛋白抑制分子SOCS3的動態(tài)變化。方法 取168只DBA1/J小鼠隨機平均分為模型組和對照組，用制備的Ⅱ型膠原乳劑免疫模型組小鼠，在初次免疫后第7、14、21天及加強免疫后第7、14、35天在無菌條件下取腹股溝淋巴結(jié)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Western印跡技術(shù)檢測各組Th17細(xì)胞及STAT3、SOCS3的變化情況。結(jié)果 模型組Th17細(xì)胞在加強免疫14 d時比正常組明顯升高(P<0.05)。模型組STAT3的表達(dá)量在初次免疫14 d時比正常組顯著升高(P<0.05)；加強免疫14、21 d比正常組顯著升高(P<0.05)。模型組SOCS3的表達(dá)量在初次免疫14 d時開始上升并持續(xù)到加強免疫14 d，與正常組比較具有明顯差異(P<0.05)。結(jié)論 Th17細(xì)胞參與了RA的炎癥進(jìn)展，其主要在CIA小鼠病程進(jìn)展中期起作用，Th17細(xì)胞在CIA小鼠病程中的變化與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3和細(xì)胞因子信號蛋白抑制分子SOCS3有關(guān)。

膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎；Th17細(xì)胞；STAT3；SOCS3

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)晚期可因嚴(yán)重骨質(zhì)破壞而導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵直、畸形、功能障礙。Th17細(xì)胞可能參與了關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷〔1～3〕；在膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型中，抑制Th17細(xì)胞，可以降低關(guān)節(jié)的腫脹度〔4〕，但在RA發(fā)病過程中，Th17細(xì)胞主要參與RA病程哪個階段目前報道不一〔5,6〕。本研究旨在觀察膠原蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠淋巴細(xì)胞Th17細(xì)胞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3和細(xì)胞因子信號蛋白抑制分子(SOCS)3與RA炎癥進(jìn)展關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 PMA/Ionomycin mixture、BFA/Monensin mixture(Multisciences)；抗鼠CD3PECy5，抗鼠CD4 FITC，抗鼠CD8PE，干擾素(IFN)-gamma PE，鼠IgG1 Isotype Contol PE，鼠IgG2 FITC(均為eBioscience)；雞Ⅱ型膠原(Chondrex)；CFA(Sigma)；抗-STAT3抗體，抗-SOCS3抗體(均為Abcam)；β-actin抗體(SANTA CRUZ)；BCA蛋白定量試劑盒，RPMI-1640培養(yǎng)液(Thermo)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，RIPA裂解液，PMSF(100 μmol/L)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD)。

1.2 雄性DBA1/J小鼠 7～8周齡(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。動物自由飲食，每籠5只，室溫(24±1)℃，濕度(55±5)%。

1.3 方法

1.3.1 建立CIA動物模型 在小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，雞Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑(CFA)等體積混合進(jìn)行乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑，以乳劑滴在水中不分散為成功標(biāo)準(zhǔn)，在無菌條件下，于小鼠尾根部進(jìn)行多點皮內(nèi)注射，每只小鼠注射0.1 ml，第21天以相同劑量加強免疫。對照組小鼠按照上述方法注入等量的生理鹽水〔7〕。

1.3.2 關(guān)節(jié)炎癥狀評分 每天觀察測量小鼠足爪關(guān)節(jié)腫脹情況，用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)來衡量足爪腫脹情況，肢體關(guān)節(jié)腫脹按0～4級評分:0級為無紅腫，評0分；1級為趾關(guān)節(jié)稍腫，評1分；2級為趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹，評2分；3級為踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹，評3分；4級為包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，評4分。AI值為四肢關(guān)節(jié)腫脹評分之和，每只小鼠最少為0分，最多為16分，AI值≥4分為造模成功〔8〕。

1.3.3 實驗動物分組及取材 168只雄性DBA1/J小鼠隨機分為對照組84只(每時間點12只)和模型組84只(每時間點12只)，在無菌條件下分離腹股溝淋巴結(jié)，提取淋巴細(xì)胞。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各時間點Th17細(xì)胞數(shù)量 制備單個淋巴細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)計數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)，然后用CD69染色檢測，確定淋巴細(xì)胞活化程度在90%以上。Th17細(xì)胞檢測：在單個淋巴細(xì)胞懸液中加入PMA/Ionomycin mixture離子霉素工作液，混勻，37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入高爾基體阻斷劑BFA/Monensin mixture混勻，在37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h。設(shè)對照管、檢測管1、檢測管2，每管加入CD4-FITC 1 μl室溫避光20 min后于每管中加入100 μl固定液A，室溫避光15 min，洗滌后重懸細(xì)胞。每管中加入100 μl破膜及溶血液B，同時加入IL-17A抗體，室溫避光15 min，洗滌后重懸細(xì)胞，上機檢測。

1.3.5 Western印跡檢測Th17細(xì)胞STAT3、SOCS3蛋白的表達(dá) 吸出淋巴細(xì)胞懸液置于離心管中，PBS 洗滌后加200 μl含蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上充分裂解 40 min后，4℃、12 000 r/min離心20 min;吸取上清，用BCA 法測蛋白濃度，煮沸5 min使蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)4℃過夜，洗膜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色液曝光顯影，用平均灰度值表示蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析或t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般情況 模型組小鼠加強免疫后活動和飲食減少，體重下降，尾根部皮膚潰瘍，加強免疫后7 d，90%以上模型鼠至少有一只足爪出現(xiàn)紅腫出血，足墊增厚，運動受限，加強免疫后14 d，模型組小鼠足爪腫脹度更高，不能負(fù)重，體重下降明顯；加強免疫后21 d，模型組小鼠足墊依舊增厚，但足爪充血腫脹程度降低，加強免疫35 d，模型組小鼠足爪紅腫明顯減輕，但足爪出現(xiàn)畸形；模型組小鼠加強免疫前及正常組小鼠無上述改變。

2.2 CIA小鼠Th17細(xì)胞及STAT3、SOCS3的動態(tài)變化 小鼠初次免疫后7、14、21 d及加強免疫7 d，模型組Th17細(xì)胞與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；加強免疫14 d，模型組Th17細(xì)胞升高，與正常組相比具有明顯差異(P<0.05)；加強免疫21、35 d，模型組Th17細(xì)胞仍高于正常組，但與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。初次免疫7 d后模型組STAT3的表達(dá)量與正常組區(qū)別不明顯(P>0.05)；初次免疫14 d后模型組STAT3的表達(dá)量與正常組相比顯著上升(P<0.05)；初次免疫21 d及加強免疫7 d后模型組STAT3的表達(dá)下降，與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；加強免疫14、21 d模型組STAT3的表達(dá)上升，與正常組比較區(qū)別明顯(P<0.05)；加強免疫35 d，模型組STAT3的表達(dá)量仍高于正常組，但與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表2。初次免疫7 d，模型組與正常組SOCS3的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；初次免疫14、21 d及加強免疫7、14 d，模型組SOCS3的表達(dá)開始上升，與正常組比較具有明顯差異(P<0.05)；加強免疫21、35 d時模型組SOCS3的表達(dá)仍高于正常組，但與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表3。

表1 Th17細(xì)胞的動態(tài)變化

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

表2 STAT3在CIA鼠病程中的動態(tài)變化

表3 SOCS3在CIA鼠病程中的動態(tài)變化

3 討 論

RA是一種常見的慢性自身免疫性疾病，CD4+T淋巴細(xì)胞亞群平衡紊亂在RA關(guān)節(jié)局部的炎癥發(fā)展和全身免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞是最新發(fā)現(xiàn)的一種輔助性T細(xì)胞(Th)，參與免疫應(yīng)答的各個階段，在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔9,10〕。Th17細(xì)胞在RA等自身免疫性疾病中的作用主要是靠其分泌的IL-17實現(xiàn)的，有研究證明，RA患者血清中IL-17的含量隨著關(guān)節(jié)腫脹度的增加而增加〔11〕。IL-17是一種功能強大的促炎性細(xì)胞因子，能夠刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)滑膜血管生成血管翳，從而使關(guān)節(jié)破壞加重，而且其可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞增生，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞〔12〕。STAT3是Th17細(xì)胞關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子，在Th17細(xì)胞分化和炎癥過程中發(fā)揮著重要作用。致炎因子 IL-6通過誘導(dǎo)活化STAT3而激活STAT3信號通路，IL-6與TGF-β共同促使初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化〔13〕，STAT3信號通路能夠激活Th17特異性轉(zhuǎn)錄子RORγt的表達(dá)，誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞分泌IL-6、IL-17等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子繼續(xù)參與上述過程，使RA炎癥反應(yīng)不斷放大〔14〕。SOCS3是Th17細(xì)胞的負(fù)調(diào)控因子，研究發(fā)現(xiàn)SOCS3依賴于STAT3 磷酸化，在TGF-β、 IL-6 和 IL-23 同時存在的情況下，SOCS3仍然抑制 Th17 細(xì)胞分化，但 SOCS3表達(dá)降低時則可誘導(dǎo) Th17產(chǎn)生，同時出現(xiàn) STAT3 高磷酸化〔15〕，因此，SOCS3在抑制Th17細(xì)胞的過程中具有非常重要的作用。但是目前，Th17細(xì)胞在病程的什么階段起作用報道不一，有研究證明，活動期RA患者Th17細(xì)胞及IL-17A水平表達(dá)明顯高于對照組，而在臨床緩解期時雖然IL-17A水平?jīng)]有差異，但是外周血Th17細(xì)胞表達(dá)依然高于對照組，Th17細(xì)胞仍參與骨質(zhì)侵蝕〔16〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在初免7、14、21 d及加強免疫7 d的時候，模型組Th17細(xì)胞與正常組細(xì)胞沒差別，可能與SOCS3的表達(dá)上升抑制STAT3有關(guān)，而且本課題組前期的實驗結(jié)果也表明此時主要是Th1細(xì)胞升高明顯〔17〕。加強免疫14 d模型組小鼠的足爪腫脹度達(dá)到最高峰，模型組Th17細(xì)胞、SOCS3、STAT3均比正常組顯著升高，說明Th17細(xì)胞參與了小鼠的關(guān)節(jié)病變，而SOCS3不足以抑制STAT3的表達(dá)。加強免疫21、35 d時小鼠足爪腫脹消退，Th17細(xì)胞、SOCS3、STAT3下降至正常水平，說明小鼠可能出現(xiàn)CD4+T細(xì)胞平衡紊亂,Th17細(xì)胞可能不是RA炎癥的啟動者，但參與了RA炎癥的進(jìn)展。

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〔2016-06-07修回〕

(編輯 郭 菁)

Dynamic changes of Th17 cells and related signaling protein of collagen-induced arthritis mice

WANG Mi,FENG Gui-Ying,SONG Hong-Ru,et al.

Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

Objective To study the dynamic changes of Th17 cells and STAT3,SOCS3 in lymphoglandula of chicken type Ⅱ collagen-induced arthritis (CIA)mice and investigate the relationship between the development of rheumatoid arthritis and the changes of Th17 cells and STAT3,SOCS3.Methods 168 DBA1/J mice were randomly divided into control group(n=12)and CIA group(n=12).They were respectively picked the lymphoglandula under the sterile condition on the initial immunization 7 d,14 d,21 d and 7 d,14,21 d,35 d after booster immunization.Then the dynamic changes of Th17 cells were detected by flow cytometry and STAT3,SOCS3 were detected by Western blot in different periods.Results Compared with the control group,the level of Th17 in the model group was significantly increased on the 14th day after booster immunization (P0.05);The level of STAT3 in the model group was significantly higher than the control group on the 14th days after initial immunization (P<0.05).However,on the 14 days and 21 days after booster immunization,the level of STAT3 was increased obviously than the control group (P<0.05).The level of SOCS3 was increased significantly on the 14th day after initial immunization (P<0.05),and still higher than the control group until to the 14 days after booster immunization (P<0.05).Conclusions The dynamic changes of CD4+Th17 and STAT3,SOCS3 might be associated with the progress of RA.

Collagen-induced arthritis;Th17;STAT3;SOCS3

國家自然科學(xué)基金資助項目(81273986)

宋鴻儒(1961-)，男，教授，主要從事中藥免疫和感染免疫研究。

王 彌(1990-)，女，碩士，主要從事中藥免疫藥理學(xué)研究。

R593.22；R392.11

A

1005-9202(2016)22-5501-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.004

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院