蔡潔新，楊立杰，趙振杰

（1.北京市房山區(qū)第一醫(yī)院檢驗科，北京102400；2.北京市第一中西醫(yī)結合醫(yī)院泌尿外科，北京100026）

·綜述·

熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測在戊肝臨床診斷效果的比較分析

蔡潔新1，楊立杰2，趙振杰1

（1.北京市房山區(qū)第一醫(yī)院檢驗科，北京102400；2.北京市第一中西醫(yī)結合醫(yī)院泌尿外科，北京100026）

目的 探討和比較熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測在戊肝臨床診斷的效果。方法 從我院健康體檢中心2013年1月至2016年1月的50500血清標本中隨機選擇100份作為研究標本。通過采用酶聯免疫法對戊肝抗體的檢測，然后再通過熒光RT-PCR檢測法進行確診，觀察和比較兩組檢測方法的檢查結果。結果 陽性一致率為55%，陰性一致率為100%，總一致率為75%，Kappa值為0.59（0.4＜Kappa≤0.75），表示兩者一致性一般。ELISA陽性檢出率為30%，PCR陽性檢出率為50%，PCR陽性檢出率明顯高于ELISA，數據比較差異具有統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.005。結論 熒光RTPCR檢測和ELISA檢測在戊肝的診斷中都具有一定的檢查準確度，同時熒光RT-PCR檢測的陽性檢出率明顯高于ELISA檢測。由于ELISA檢測容易受到各方面因素的影響而發(fā)生漏診的情況，因此建議對于ELISA檢測出現可疑的標本，使用RT-PCR進行確診，使更具可靠性。

熒光RT-PCR檢測； ELISA檢測； 戊肝； 臨床診斷

戊型肝炎（HE），屬于一種非甲非乙型病毒性肝炎，主要由戊型肝炎病毒感染所導致，其發(fā)病者不僅僅限于人類，還包括牲畜，傳播途徑主要有糞、口途徑［1-3］。目前，戊型肝炎在世界各國都有發(fā)病，主要集中在亞、非、拉等發(fā)展中國家，多發(fā)于青壯年人群，病死率達到0.1%～4.0%，孕婦病死率甚至高達25%［4-5］。現如今，臨床檢測戊型肝炎的主要方法包括血清學抗體ELISA、和RT-PCR病原學檢測。在本文中主要通過對我院戊型肝炎患者的診斷資料進行回顧性分析，探討和比較熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測在戊肝臨床診斷效果。

材料和方法

1 一般資料

從我院健康體檢中心2013年1月至2016年1月的50500血清標本中隨機選擇100份作為研究標本。

2 研究方法

2.1檢測方法 通過采用酶聯免疫法對戊肝抗體進行檢測，然后再通過熒光RT-PCR檢測法進行確診，對兩種方式的檢測結果進行對比分析。

2.2檢測儀器和試劑 酶聯免疫法試劑盒，上海科華試劑盒；Anthos2010酶標儀器設備，北京普朗生產；RNA提取試劑盒，產自QIAGEN公司；實時熒光定量PCR儀器（型號：CFX96Touch，廠家：美國BIO-RAD公司）。

2.3酶聯免疫檢測法 按照酶聯免疫監(jiān)測的試劑盒說明書對患者的血清標本HEV-IgM抗體進行檢測。如果患者Cutoff值比OD值小或者相當OD值，那么應當評定為陽性；如果患者Cutoff值比OD值更大，那么評定為陰性［6］。操作兩次，前后兩次皆為陽性確診為陽性，皆為陰性確診為陰性，兩次結果不一致則列為可疑病例。

2.4熒光RT-PCR檢測法 首先提取戊肝RNA，在提取的過程中必須按照RNA試劑盒的說明書進行，然后采用熒光RT-PCR檢測HEV-RNA［1-2］。

PCR引物設計的原則如下：GC含量范圍為30%～80%，不能有6個相同堿基，避免二級結構，在75～200bp范圍的產物內進行擴增，保證引物tm值低于探針tm值的百分之十，最后進行序列同源性檢驗。引物與探針是上?；瞪锇凑諏＠鸆N101122563 A合成。根據專利CN101122563 A的要求，反應體系必須滿足以下幾點條件：熒光探針設置為150nmol/L；上下游引物分別選擇0.4 μmol/L；二硝基酚，量為0.3mmol/L；氯化鎂，量為2 5 mmol/L；選擇5μL模板，5×Real-Time PCR Buffer 5 μL，ExTaq HS 0.025 U/μL。擴增環(huán)境需在94℃的環(huán)境中進行預變性2min，一共需要經歷45個循環(huán)。當CT值＞45，則評定為陽性［7］。

3 統(tǒng)計學處理

對熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測戊肝的一致性進行Kappa檢驗，在參考值為0～1的范圍檢驗。如果Kappa值為1，則熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測戊肝完全一致；如果Kappa取值范圍在0.75～0.99之間，則表示熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測戊肝具有較理想的一致性；如果Kappa取值范圍在0.4～0.75之間，則表示熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測戊肝的一致性一般；如果Kappa取值范圍在0～0.4之間，則表示熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測戊肝的一致性較差。對熒光RT-PCR檢測與ELISA檢測戊肝的結果是否存在差異進行卡方檢驗，當P＜0.05時，數據比較差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

1 ELISA檢測結果

在100例標本中，ELISA結果陽性30例，陽性檢出率為30%，陰性50例，陰性率檢出率50%，可疑病例20例。

2 熒光PCR檢測結果

在100例標本中，熒光定量PCR結果陽性 55例，陽性檢出率為55%，陰性45例，陰性檢出率45%。

3 ELISA檢測vs熒光PCR檢測

ELISA檢測和熒光PCR檢測都為陽性的結果30例（30%），都為陰性的結果45例（45%），一共有25例檢測結果不一致。其中5例（5%）ELISA檢測為陰性，熒光PCR檢測為陽性；20例（20%）ELISA檢測為可疑病例，熒光PCR檢測為陽性。

對ELISA和PCR做Kappa檢驗，評價二者的一致性，得到如下結果：陽性一致率為55%（30/55），陰性一致率為100%（45/45），總一致率為75%（30 +45+0/100），Kappa值為0.59（0.4＜Kappa≤0.75），表示兩者一致性一般。

對ELISA和PCR的結果做卡方檢驗，評價二者的陽性檢出率，計算可得：ELISA陽性檢出率為30%，PCR陽性檢出率為55%，PCR陽性檢出率明顯高于ELISA，數據比較差異具有統(tǒng)計學意義，P= 0.000＜0.005。

討論

1 ELISA檢測在戊肝診斷中的應用

酶聯免疫法（ELISA），又稱之為固相酶聯免疫法，利用化學反應連接檢測對象和酶，然后利用免疫反應結合檢測對象和固相載體上的抗原，最后把底物加進去，對其顯示的顏色進行觀察，并且根據顏色的深淺程度對抗體的水平進行判斷。酶聯免疫檢測法目前在戊肝檢測中應用極為廣泛，該種方法能夠對戊肝病毒進行定性檢測，其靈敏度高，特異度高，并且檢查成本低廉，無污染［8-9］。根據本文研究結果可見，采用ELISA檢測戊肝，其存在20例弱陽性病例，究其原因，通常而言，采用酶聯免疫檢測法對急性期發(fā)病患者的血清抗HEV-IgM抗體進行檢測，其抗HEV-IgM抗體明顯升高，以此為診斷HEV。然而，該種檢測方法受到一些因素的影響：其一，采集血液標本的患者正好處于HEV窗口期，此時病毒尚未陽轉；其二，在發(fā)病早期抗HEV-IgM抗體較低，患者對該種病毒不產生應答。上述的情況是導致HEV病毒感染血清標志物顯示為陰性的重要原因，容易導致漏診的發(fā)生。

2 抗原RT-PCR檢測在戊肝診斷中的應用

因為感染個體HEV的含量并不是無限的，所以，可以通過對靶病毒進行擴增來進行檢測?？乖璕T-PCR因此被廣泛應用于檢測戊肝抗原病毒。戊肝病原定性檢測主要用在確診HEV感染的過程中，需要使用兼并引物，并且需要根據毒株的保守序列對引物進行設計引物，從而實現RT-PCR的擴增目的［10-12］。根據本文研究結果熒光定量PCR結果陽性55例，陽性檢出率為55%，陰性45例，陰性檢出率45%，可疑病例為0?？梢姡捎脽晒舛縍TPCR檢測技術對戊型肝炎病毒進行檢測，不僅具有較高的準確度，而且檢出迅速，靈敏度高，重復性良好，有利于在戊型肝炎病毒感染早期進行快速診 斷［13-14］。

3 比較RT-PCR檢測與ELISA檢測在戊肝診斷中的應用

根據本文研究可知，Kappa值為0.59（0.4＜Kappa≤0.75），這兩種方法在檢測戊肝方面一致性一般；同時，與 ELISA檢測對比，PCR陽性檢出率明顯更高（P=0.000）。究其原因，對于戊肝多采用ELISA檢測血清中抗HEV-IgM，因為不同生產產家使用的試劑盒有所區(qū)別，因此檢出率存在一定的差異，這是導致漏檢發(fā)生的原因之一。除此之外，采用酶聯免疫檢測法檢測HEV感染會受到一些因素的限制，例如診斷抗原包含的抗原表位數量較少等，這些因素會對ELISA檢測的靈敏度和特異度造成不良的影響。而采用實時熒光定量PCR檢測則具有高靈敏度和特異度的優(yōu)點，并且檢出速度快，具有良好的重復性［15］。

綜上所述，熒光RT-PCR檢測和ELISA檢測在戊肝的診斷中都具有一定的檢查準確度，同時熒光RT-PCR檢測的陽性檢出率明顯高于ELISA檢測。由于ELISA檢測容易受到各方面因素的影響而發(fā)生漏診的情況，因此建議對于ELISA檢測出現可疑的標本，使用RT-PCR進行確診，更具可靠度。

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（潘子昂編輯）

Comparative Analysis of RT-PCR and ELISA Detection in
Clinical Diagnosis of Hepatitis E

CAI Jie-xin，YANG Li-jie，ZHAO Zhen-jie
（Clinical Laboratory，the First Hospital of Beijing Fangshan，Beijing 102400，China）

Objective To explore and compare RT-PCR and ELISA detection on hepatitis E and clinical diagnostic value.Methods A total of 100 samples were randomly selected from 50500 serum samples in our hospital from January 2013 to January 2016.Samples were tested by ELISA，and then by RT-PCR.Results Were compared between the two groups.The positive agreement rate was 55%and negative agreement rate was 100%.The total agreement rate was 80%.Kappa value was 0.87（0.75＜kappa is less than or equal to 0.99），and the correlation between two was slightly above average.The positive rate of ELISA was 30%，the positive rate of PCR was 50%，the positive rate of ELISA was significantly higher than that of PCR，the difference was statistically significant，P=0.000＜0.005.Conclusion RT-PCR and ELISA in the diagnosis of hepatitis E show equally specific.RT-PCR has higher positive rate than that of ELISA.It is recommended that ELISA can be used as first choice of screeningof suspicious specimens，RT-PCR can be added as aconfirmation of the diagnosis.

RT-PCR fluorescence detection； ELISA detection； Hepatitis； Clinical diagnosis

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.030

2016-05-16；

2016-06-02