寇瑩瑩 宋英今 楊少輝王潔華

天津大學環(huán)境科學與工程學院, 天津 300072

植酸酶phyA基因的密碼子優(yōu)化及其在大豆中的表達

寇瑩瑩 宋英今 楊少輝*王潔華

天津大學環(huán)境科學與工程學院, 天津 300072

植酸是植物源食品中的主要抗營養(yǎng)成分, 降低植酸含量可有效提高大豆的營養(yǎng)利用率。本文根據大豆密碼子使用偏好性, 對無花果曲霉植酸酶 phyA基因進行密碼子優(yōu)化, 人工合成了適合在大豆中表達的 phyA(b)基因。以pCAMBIA3301為骨架, 構建由大豆凝集素基因啟動子和信號肽序列調控的植物表達載體pCBPS-phyA(b)。用農桿菌介導法遺傳轉化吉林35大豆子葉節(jié)。PCR檢測表明目的基因已初步整合至大豆基因組中; bar試紙條表明所有陽性植株中均能檢測到 bar基因的蛋白產物; 除草劑葉片涂抹顯示野生型的葉片出現黃化或枯萎現象, 而轉基因植株葉片表現正常, 具除草劑抗性; 以半定量RT-PCR共篩選到13株轉phyA和19株轉phyA(b)陽性轉基因大豆植株。通過對轉基因大豆T3種子中植酸酶活性、無機磷和植酸磷含量等檢測, 證明人工基因phyA(b)比phyA在大豆種子中所表達的植酸酶具有更高的活性, 說明密碼子優(yōu)化有利于提高外源基因的表達。

大豆; phyA基因; 密碼子優(yōu)化; 遺傳轉化

植酸(phytic acid, PA), 又稱肌醇六磷酸, 是植物種子中磷的主要儲存形式[1]。植酸有12個可解離的氫原子, 極易與礦質元素(如磷、鈣、鐵、鋅、鎂等)和蛋白質(如淀粉酶、脂肪酶等)螯合形成難溶性物質, 是影響植物源食品中礦質元素和蛋白質吸收的主要抗營養(yǎng)成分[2]。植酸酶(phytase)是催化植酸及其鹽類分解成肌醇和無機磷酸鹽的一類磷酸酶, 可以將磷、鈣、鎂等礦物元素和肌醇從植酸鹽中釋放出來, 可解除植酸的抗營養(yǎng)作用[3]。

20世紀90年代開始, 有關植酸酶植物基因工程的研究已有很多報道, 如大豆、油菜、木豆、玉米等[4-10]很多植物中都表達了重組的真菌植酸酶。2008年, Chen等[8]利用玉米種子特異性globulin-1啟動子,將黑曲霉phyA基因轉化玉米, 轉基因玉米種子中植酸酶的表達為2200 U kg-1, 比對照增加了近50倍。2009年和2011年, Li等[4]和Yang等[5]分別將根特異啟動子pyk10和組成型啟動子35S-35S調控下的無花果曲霉植酸酶(Aspergillus ficuum 3.4322) phyA基因轉化大豆, 結果表明phyA可以在大豆中表達, 表現出較高的植酸酶活性[4-5]。

植酸的生物合成可能發(fā)生在細胞質或內質網中,然后轉運至蛋白體, 最后在液泡中積累[11]。高等植物細胞中, 細胞質的pH值(一般為7.0～7.5)高于液泡內的 pH值(一般為 5.5), 目前鑒定的各種來源的植酸酶中, 除百合花粉植酸酶外, 均為酸性植酸酶,最適pH值在2～6之間, 如大腸桿菌appA植酸酶最適pH值為4.5, 無花果曲霉植酸酶phyA最適pH為5.5[12]。所以, 利用液泡定位表達信號肽, 如大豆凝集素基因信號肽, 將外源植酸酶定位至液泡中, 可能會更好地提高植酸酶活性, 降低種子內的植酸水平。Coello等[11]將大腸桿菌的植酸酶appA基因連同一段液泡定位表達信號肽序列, 在胚特異性啟動子的控制下轉化擬南芥, 在轉基因植株干種子中檢測到植酸酶的活性, 且內部植酸的水平有所降低, 無機磷酸鹽的含量相對提高。

生物體內普遍存在同義密碼子非均衡使用的現象, 這種現象會導致外源基因在宿主細胞中的表達量降低。使用轉基因受體系統(tǒng)偏愛密碼子是提高外源基因表達水平的一種有效手段[11]。陳惠等[13]根據畢赤酵母偏愛密碼子, 將來源于黑曲霉 N25的植酸酶基因phyA改造, 結果表明密碼子優(yōu)化的酵母轉化子中植酸酶活性為對照的 2倍。目前, 有些植物中利用密碼子優(yōu)化的外源基因已獲得了重組蛋白高表達的轉基因植株[14-17], 但還未見有通過人工優(yōu)化真菌植酸酶基因, 提高受體植物植酸酶表達水平的報道。

本研究根據大豆密碼子偏好性, 對無花果曲霉phyA基因優(yōu)化改造, 以原始 phyA基因和人工phyA(b)基因分別轉化大豆, 通過轉基因植株后代種子植酸酶活性、無機磷和植酸磷含量等檢測, 以驗證密碼子優(yōu)化合成的植酸酶基因的正確性及在大豆中的表達效率, 并為種子特異性表達植酸酶獲得低植酸大豆奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α、根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404、 載 體pCAMBIA3301由本實驗室保存。無花果曲霉(Aspergillus ficuum 3.4322) phyA基因由南開大學生命科學學院李明剛教授提供。大豆品種吉林35由河北農業(yè)大學農學院提供。各種限制性內切酶、連接酶等分子生物學操作試劑購自TaKaRa公司。激素、抗生素等生化試劑購自Sigma公司。所用培養(yǎng)基及其成分參見文獻[4-5]。

1.2 無花果曲霉phyA基因的密碼子優(yōu)化

利用CUTG網站http：//www.kazusa.or.jp/codon/,查找大豆密碼子頻率的相關數據, 選用1207個基因CDS (495 060 codons)分析大豆中每個氨基酸的密碼子頻率, 獲得大豆密碼子使用情況表。通過在線密碼子分析軟件 Graphical Codon Usage Analyser (http：//gcua.schoedl.de/), 分析無花果曲霉(Aspergillus ficuum 3.4322)植酸酶phyA基因(登錄號為AF537344)在大豆中表達時每一密碼子的使用頻率, 在保證氨基酸序列完整性的前提下, 按照大豆對密碼子的偏好性特點, 優(yōu)化設計phyA序列, 交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成全序列。

1.3 植物特異性表達載體的構建

根據NCBI公布的大豆凝集素(Le3)基因啟動子和信號肽序列(登錄號為 EU070415), 設計特異性引物, 以大豆基因組DNA為模板, 進行PCR擴增。擴增產物經純化回收, 與T-Vector pMD19連接, 獲得克隆載體pMD19-Le3PS, 測序驗證。以pCAMBIA3301為骨架, 利用In-Fusion HD EcoDry Cloning Plus kits (TaKaRa), 將大豆凝集素基因啟動子和信號肽序列(Le3PS)和植酸酶基因串聯(lián)在一起, 構建植物胚特異性表達載體pCBPS-phyA和pCBPS-phyA(b), 篩選標記為草胺膦乙酰轉移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase, bar)(圖1)。

圖1 植物表達載體pCBPS-phyA和pCBPS-phA(b)Fig. 1 Structure of the plant expression vectors pCBPS-phyA and pCBPS-phyA(b)

1.4 農桿菌介導的大豆遺傳轉化

采用農桿菌介導的子葉節(jié)法進行大豆遺傳轉化[4-5]。將已構建好的植物表達載體 pCBPS-phyA和pCBPS-phyA(b), 通過電擊法轉入根癌農桿菌LBA4404。大豆干種子經氯氣滅菌后, 無菌水浸泡8～10 h, 切取子葉節(jié)并在農桿菌菌液中浸泡15 min;取出外植體并轉入共培養(yǎng)培養(yǎng)基; 28℃暗培養(yǎng)2～3 d后, 將外植體轉入不定芽誘導培養(yǎng)基(含 50 mg L-1Basta); 培養(yǎng) 2周后, 轉入芽伸長培養(yǎng)基; 繼代 2～3次, 待抗性芽長至約3 cm左右時, 將其剪下插入生根培養(yǎng)基誘導生根, 根長2 cm左右時馴化移栽。

1.5 轉基因陽性植株的鑒定

1.5.1 PCR檢測 采用Plant DNA Isolation Reagent (TaKaRa)提取大豆苗基因組DNA, phyA基因引物為phyA-F： 5′-ATGCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3′和phyA-R： 5′-CTAAGCAAAACACTCCGC-3; phyA(b)基因引物為 phyA(b)-F： 5′-ATGCTTGCAGTTCCTG CTTC-3′和 phyA(b)-R： 5′-CTAAGCAAAACACTCC GCCCA-3′。PCR反應條件為95℃ 5 min; 95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 80 s, 35個循環(huán); 72℃ 5 min。

1.5.2 轉基因檢測試紙條法 取少量葉片放入1.5 mL EP管中, 研碎后加入0.1 mL抽提液并攪拌均勻, 將LibertyLink (bar)試紙條插入混合液, 5 min后觀察結果。

1.5.3 除草劑葉片涂抹法 100 mg L-1Basta中加入0.1%的Tween-20, 用毛筆涂抹植株的半片葉子,另半片葉子用記號筆標記作為對照, 3～5 d后觀察葉片反應。

1.5.4 半定量 RT-PCR檢測 采用 MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa)提取葉片總RNA, PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa)反轉錄為cDNA,利用半定量RT-PCR分析外源基因的表達情況。phyA基因引物為 phyA-F： 5′-ATGCTGGCAGTCCCCG CCTCGAG-3′和 phyA-R： 5′-GGCTGAGCACGAGG ATCC-3′。phyA(b)基因引物為phyA(b)-F： 5′-ATGCT TGCAGTTCCTGCTTCTAG-3′和phyA(b)-R： 5′-GGC TGAGCTCTAGGATCT-3′。內參基因 Actin (登錄號為V00450.1)引物為Actin-F： 5′-CTCAACCCAAAG GTCAACAG-3′和Actin-R： 5′-TCTAGGGCAACATA TGCAAG-3′。

1.6 轉基因大豆種子中植酸酶活性、PA和Pi含量的測定

參照 Bilyeu等[10]方法分析植酸酶活性, 一個植酸酶活性單位被定義為每分鐘每毫克蛋白釋放無機磷的μmol數。參照Chen等[8]的三氯化鐵比色法測定植酸(PA)含量; 參照Dorsch等[18]的鉬藍比色法測定無機磷(Pi)含量。

2 結果與分析

2.1 phyA基因的密碼子優(yōu)化

利用CUTG和Graphical Codon Usage Analyser對大豆密碼子使用頻率和無花果曲霉 phyA密碼子使用情況分析比較(圖2)。

由圖2可以看出, 有6個密碼子在大豆中表達時偏好性較強, 表達效率小于 50%, 很可能影響產物表達。如編碼精氨酸Arg的CGG (29%)、CGC (45%)和CGT (45%), 編碼脯氨酸Pro的CCG (27%), 編碼絲氨酸Ser的TCG (36%)和編碼纈氨酸Val的GTC (46%)。為實現無花果曲霉植酸酶基因phyA在大豆中的高效穩(wěn)定表達, 在氨基酸序列保持不變的前提下, 替換上述6個密碼子, 將CGC、CGG和CGT替換為AGA, CCG替換為CCT, TCG替換為TCT, GTC替換為GTT, 共改變85個堿基, 涉及76個密碼子,改變率為 16.93%。新基因 G+C含量更靠近大豆內源基因G+C含量, 由55.7%下降至49.8%, 比原始含量降低了 5.9%。改造后的 phyA(b)基因具有大豆基因的密碼子特征。

2.2 抗性植株的獲得及轉基因陽性植株的鑒定

轉化的大豆品種吉林 35經過抗性芽誘導、伸長、生根和移栽等一系列過程(圖3), 獲得T0代Basta大豆抗性苗 58株, 其中轉 phyA基因抗性苗 25株,轉phyA(b)基因抗性苗33株。對抗性苗基因組DNA進行PCR擴增, 13株轉 phyA基因大豆和 19株轉phyA(b)基因大豆中能檢測到 1350 bp的目的片段,說明目的基因已初步整合至大豆基因組中(圖 4-A);使用PAT/bar轉基因試紙條對上述PCR陽性植株進一步檢測表明所有植株中均能檢測到 bar基因的蛋白產物(圖 4-B); 除草劑葉片涂抹試驗表明, 野生型對照的葉片出現黃化或枯萎現象, 而轉基因大豆植株葉片表現正常, 呈現除草劑抗性(圖4-C)。

2.3 轉基因大豆的半定量RT-PCR檢測

提取 T0轉基因大豆葉片的總 RNA, 反轉成cDNA進行RT-PCR分析(圖5), 結果表明, 轉基因植株能夠擴增出大小一致但亮度不一的目的條帶, 野生型對照沒有出現相應條帶, 表明外源基因在轉基因大豆體內可以正常表達, 不同植株體內外源基因的表達水平不同。選取外源基因表達量高的植株,包括轉phyA基因的A2、A8、A9株系和轉phyA(b)基因的b2、b6和b8株系的T3代, 測定植酸酶活性、無機磷和植酸磷含量。

圖2 大豆密碼子使用頻率(黑色)和無花果曲霉phyA基因密碼子使用頻率(紅色)Fig. 2 Comparison of codon usage frequency of soybean (black) and that of phyA gene in Aspergillus ficuum (red)

2.4 轉基因大豆T3代種子植酸酶活性檢測

根據RT-PCR結果, 分別測定3個轉phyA基因和3個轉phyA(b)基因的T3代大豆種子中的植酸酶活性、無機磷和植酸磷含量(表1)。結果表明, 與野生型相比, 3個轉phyA基因株系和3個轉phyA(b)基因株系的T3種子中植酸酶活性均有顯著提高。而且,轉 phyA(b)基因株系的植酸酶活性普遍高于轉 phyA基因株系, 表明密碼子優(yōu)化有利于提高外源基因的表達。在轉phyA基因株系中, AL8-3的植酸酶活性最高, 為91 μmol mg-1min-1; 在轉phyA(b)基因株系中, bL6-1的植酸酶活性最高, 達到 116 μmol mg-1min-1, 比AL8-3提高了27.48%。

與野生型相比, 3個phyA(b)株系和3個phyA株系T3代種子中的植酸磷含量顯著降低, 無機磷含量顯著提高, 總磷含量變化不明顯。其中轉phyA(b)基因株系bL6-1的植酸磷含量為1.36 μg mg-1, 僅為野生型4.83 μg mg-1的28.16%, 比AL8-3的2.11 μg mg-1降低了 35.55%; bL6-1株系無機磷含量比野生型對照凈增6.9倍, 達4.11 μg mg-1, 是AL8-3株系的1.24倍。

此外, 試驗表明各株系植酸酶的含量與各自的外源基因表達水平(半定量RT-PCR結果)相關, 表達量越高的植株, 植酸酶活性也越高, 相應其植酸含量降低的也越明顯。對照和 6個轉基因株系的植酸酶活性為 bL6-1＞bL8-2＞bL2-3＞AL8-3＞AL9-5＞AL2-2＞WT。推斷轉基因植株中植酸酶活性受到外源植酸酶基因表達水平的影響, 增加植株體內的植酸酶活性, 降低種子中的植酸含量。本試驗中, 人工基因phyA(b)比未改造的phyA基因在大豆種子中所表達的植酸酶具有更高的活性, 表明密碼子優(yōu)化有利于提高外源基因的表達。

圖3 農桿菌介導的大豆子葉節(jié)遺傳轉化流程Fig. 3 Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node as explantsA： 共培養(yǎng)2 d的外植體; B： 不定芽誘導培養(yǎng)2周; C： 不定芽誘導培養(yǎng)4周; D： 芽伸長培養(yǎng); E： 抗性芽生根; F： 移栽后的轉基因植株。A： explants at two days after co-culture; B： adventitious bud at two weeks after selection on shoot induction (SI) medium; C： adventitious bud at four weeks after selection on SI medium; D： shoot elongation (SE) on medium; E： rooting of the resistant shoot; F： transgenic plants in pots.

圖4 T0代轉基因植株的鑒定Fig. 4 Identification of T0transgenic plantsA： PCR檢測; M： DNA marker; 1和11： 野生型對照; 2和12： 質粒對照; 3～10,11～20： 轉基因植株; B： bar轉基因試紙條檢測。CK：野生型; 1～3： 轉基因植株; C： 除草劑涂抹鑒定. CK： 野生型; 1～3：轉基因植株。A： PCR detection. M： DNA marker; 1： wild type; 2： plasmid; 3-10：transgenic plants; B： LibertyLink strip test. CK： wild type plants; 1-3： transgenic plants; C： test of herbicide resistance on leaf.

圖5 T0代抗性植株phyA或phyA(b)基因的RT-PCR檢測結果Fig. 5 RT-PCR analysis of phyA or phyA(b) gene of T0transformed soybean plantsA： 轉pCBPS-phyA載體; B： 轉pCBPS-phyA(b)載體; 1： 野生型; 2～9： 部分轉化植株。A： transformation with pCBPS-phyA vector; B： transformation with pCBPS-phyA(b) vector; 1： wild type; 2-9： transgenic plants.

表1 轉基因大豆T3種子的植酸酶活性、植酸磷和無機磷含量性狀分析Table 1 Phytase activity, Pi, and phytate content of transgenic soybean T3seeds

3 討論

在長期的進化過程中, 對于一個特定氨基酸的同義密碼子, 不同物種會形成不同的偏愛性。由于外源基因與轉基因受體系統(tǒng)在密碼子偏愛上的不同,經常造成外源基因難以有效翻譯。因此, 適當地將外源基因的密碼子替換成為受體系統(tǒng)偏愛的密碼子,可以提高外源基因在該系統(tǒng)中的表達水平[14-17]。近幾年來, 雖然關于密碼子優(yōu)化的研究多為在大腸桿菌或酵母中的異源表達, 但在玉米、水稻、番茄等植物中, 也有成功報道。Jabeen等[16]研究表明, 密碼子優(yōu)化的cry1Ab基因在植物原生質體中的表達水平提高了4～6倍。Tang等[19]以密碼子優(yōu)化的Cry1A(c)基因轉化水稻, 轉基因水稻葉片中 Cry1A(c)蛋白含量達到 1.38 μg g-1, 田間和室內抗蟲實驗都顯示對鱗翅目害蟲有很好的毒殺效果。上述研究為我們探討優(yōu)化改造無花果曲霉植酸酶基因, 提高轉基因大豆中植酸酶的活性, 提供了參考依據和理論基礎。

本試驗按照無花果曲霉 phyA蛋白的氨基酸序列和大豆偏愛密碼子, 優(yōu)化并人工合成了phyA(b)基因, 轉 phyA(b)基因株系 bL6-1的植酸酶活性比轉phyA基因的AL8-3株系提高了27.48%, 植酸磷含量降低了 35.55%, 無機磷含量增加并達到 AL8-3的1.24倍。證明本試驗采取的優(yōu)化并改造密碼子提高外源基因表達水平的策略有效, 為優(yōu)化改造微生物基因轉化植物的研究奠定了基礎, 并豐富了植物轉基因分子育種的基因資源。

基因工程育種的目的是不改變植物原有優(yōu)良性狀, 并獲得相應的目的性狀。植酸在種子發(fā)育和萌發(fā)過程中具有非常重要的生理作用。2006年, Nunes等[20]利用RNAi技術敲除GmMIPS1表明, 阻斷植酸的生物合成會對種子萌發(fā)產生顯著的副作用。種子貯藏蛋白基因啟動子(如大豆凝集素基因啟動子)的轉錄功能具有顯著的組織和發(fā)育時期特異性, 僅在種子成熟過程的中期至后期指導其下游基因的表達[11]。Bilyeu等[10]將大腸桿菌植酸酶 appA基因置于大豆凝集素基因啟動子的調控下轉化大豆, appA基因在發(fā)育中的子葉細胞質中高水平表達。因此, 本試驗將phyA和phyA(b)基因連同一段液泡定位表達信號肽序列(大豆凝集素基因信號肽), 在胚特異性啟動子(大豆凝集素基因啟動子)的控制下轉化大豆。結果卻在獲得的轉基因材料后代中,植酸酶活性雖有不同程度提高, 但不同株系植酸酶活性、植酸磷含量及無機磷含量卻不同。今后需進一步研究這些轉基因材料的其他農藝性狀, 如種子萌發(fā)率和種子干重等, 以篩選獲得植酸含量顯著降低、種子萌發(fā)率和種子干重不受顯著影響的轉基因大豆材料, 從而為低植酸轉基因大豆育種奠定基礎, 以實現從源頭避免植酸的抗營養(yǎng)作用, 提高大豆源食物或飼料營養(yǎng)成分的有效利用率。

4 結論

通過對無花果曲霉植酸酶 phyA基因的密碼子優(yōu)化, 人工合成了適合在大豆中表達的 phyA(b)基因。以 phyA和 phyA(b)基因分別轉化大豆證明, phyA(b)比 phyA在大豆種子中所表達的植酸酶活性更高, 密碼子優(yōu)化有利于提高外源基因的表達。

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Codon Optimization and Expression of phyA Gene in Soybean (Glycine max Merr.)

KOU Ying-Ying, SONG Ying-Jin, YANG Shao-Hui*, and WANG Jie-Hua

School of Environment Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China

Phytic acid is the main anti-nutritional components in the plant origin food. Reducing the phytic acid content of transgenic plants is an effective way to improve the nutrient utilization rate of soybean. In this research, the codons of Aspergillus ficuum phyA were optimized according to the codon usage bias in soybean. The phyA(b) gene with scheming DNA sequence was synthesized chemically, which was suitable for expression in soybean. The plant expression vector pCBPS-phyA(b) was constructed. In the vector, phyA(b) gene was driven by promoter of soybean lectin gene and signal peptide sequence, and transformed into Jilin 35 via Agrobacterium-mediated method. PCR detection indicated that the target gene was successfully integrated into soybean genome. The protein product of bar gene could be detected in all positive plants by LibertyLink strip analysis. Herbicide leaf painting showed that leaves of wild-type plants were lesioned, while there of transgenic plants remained green. In total, 13 phyA transgenic plants and 19 phyA(b) transgenic plants were verified by semi quantitative RT-PCR. The detection results of phytase activity, inorganic phosphorus content and phytic acid content in T3transgenic soybean seeds, showed that the artificial phyA(b) gene was successfully expressed in soybean, and the phytase activity in phyA(b) gene transforming plants was significantly higher than that in phyA gene transforming plants. It is suggested that codon optimization can significantly improve the expression of foreign genes.

Soybean; phyA gene; Codon optimization; Genetic transformation

10.3724/SP.J.1006.2016.01798

本研究由國家轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0800404B)資助。

This work was supported by the National Transgenic Major Project of China (2014ZX0800404B).

*通訊作者(Corresponding author)： 楊少輝, E-mail： shaohuiyang77@tju.edu.cn

聯(lián)系方式： E-mail： 15620071109@163.com

稿日期)： 2016-02-28; Accepted(接受日期)： 2016-06-20; Published online(

日期)： 2016-06-27.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160627.0837.016.html