第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科(西安 710038)

崔 凱 王武平△ 孫 盈 趙 芳 高貴洲 王曉東 倪云峰 張 濤 盧 強(qiáng) 李小飛

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非小細(xì)胞肺癌中Twist通過(guò)TGF-β/Smad3信號(hào)通路促進(jìn)EMT的發(fā)生

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科(西安 710038)

崔 凱 王武平△孫 盈 趙 芳 高貴洲 王曉東 倪云峰 張 濤 盧 強(qiáng) 李小飛

目的：探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織轉(zhuǎn)錄因子Twist調(diào)控TGF-β/Smad3的表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生機(jī)制。方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NSCLC組織樣本中Twist、TGF-β/Smad3以及EMT中代表性分子E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)分析二者表達(dá)之間的相關(guān)性。結(jié)果：Twist、Smad3、Vimentin蛋白陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，E-cadherin蛋白陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞膜。Twist、Smad3、E-cadherin、Vimentin蛋白在NSCLC中陽(yáng)性率分別為72.3%(120/166)、71.1%(118/166)、54.2%(90/166)、69.9%(116/166)，顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Twist與Smad3、Smad3與E-cadherin、Vimentin在NSCLC不同分化程度及不同TNM分期均呈顯著相關(guān)。結(jié)論：NSCLC中Twist可能通過(guò)TGF-β/Smad3信號(hào)通路促進(jìn)EMT的發(fā)生。

Twist基因，一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，正常情況下主要表達(dá)于胚胎中胚層、胎盤(pán)和成人的某些中胚層來(lái)源的未分化組織[1]，但在某些腫瘤組織中如胃癌[2]、前列腺癌[3]、乳腺癌也出現(xiàn)高表達(dá)[4]，提示其可能與腫瘤形成相關(guān)。隨后研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)Twist還是影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)過(guò)程中的重要分子，即能夠抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄而使得上皮細(xì)胞不能形成具有粘附特性的成熟上皮細(xì)胞，進(jìn)而促使其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[5]，而EMT的形成能夠影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[6]，由此推測(cè)Twist是一種癌基因。Twist基因作為一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)何種分子調(diào)控肺癌EMT發(fā)生并不明確。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，可誘導(dǎo)EMT發(fā)生的分子信號(hào)通路主要有TGF-β/SMAD3信號(hào)通路[7-8]、IL-6/STAT3信號(hào)通路[9-10]等。在細(xì)胞內(nèi)，各種信號(hào)通路之間并不是孤立存在的，而是通過(guò)相互調(diào)控、相互制約作用形成一個(gè)復(fù)雜有序的網(wǎng)絡(luò)[11]。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)組織樣本中Twist、TGF-β/Smad3以及EMT中代表性分子E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)分析這幾者表達(dá)之間的相關(guān)性，初步探討NSCLC中Twist調(diào)控EMT發(fā)生的分子機(jī)制，為闡明NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供依據(jù)。

材料與方法

1 材料選擇

1.1 病理資料和組織標(biāo)本： 研究所用的石蠟包埋標(biāo)本取自第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科實(shí)驗(yàn)室的組織標(biāo)本庫(kù)。標(biāo)本選取的對(duì)象為2006年1月至2009年1月在我院連續(xù)收治的行根治性切除手術(shù)的NSCLC患者，共計(jì)166 例，有以下情形之一者予以排除：術(shù)前曾接受過(guò)化療、放療或者同步放化療；術(shù)前曾接受過(guò)TKIs類藥物如吉非替尼、厄洛替尼等靶向藥物的治療。所有患者的術(shù)后病理結(jié)果均被證實(shí)為NSCLC。所有癌組織標(biāo)本均有配對(duì)的正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照。對(duì)應(yīng)的166肺癌患者臨床資料信息保存完整，包括：年齡、性別、臨床表現(xiàn)、手術(shù)方式、腫瘤的大小、組織學(xué)類型、分化程度、淋巴結(jié)狀態(tài)等。另外，選取與實(shí)驗(yàn)組相對(duì)應(yīng)的50例癌旁正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照組。該研究已通過(guò)第四軍醫(yī)大學(xué)臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者臨床信息資料的獲得和腫瘤組織樣本的使用均得到患者或家屬的書(shū)面同意。

1.2 主要試劑、儀器及來(lái)源： Twist兔單克隆抗體(Abcam公司)，Smad3兔單克隆抗體(Abcam公司)，E-cadherin兔多克隆抗體(Gene tex公司)，Vimentin兔單克隆抗體(Gene tex公司)，β-actin單克隆抗體(Abcam公司)，兔Streptavidin-HRP試劑盒(帶DAB顯色液，北京康為世紀(jì)公司)，恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)，移液器(賽默飛公司)，低溫冰箱(賽默飛公司)，漩渦混合儀(北京同方公司)，高速控溫離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特有限公司)。

2 研究方法

2.1 免疫組化步驟：石蠟包埋的組織塊被切成厚度約為4μm切片經(jīng)載玻片撈上后在烤片機(jī)上進(jìn)行烤干。之后將石蠟切片在二甲苯中進(jìn)行脫蠟，通過(guò)一系列的酒精梯度溶液進(jìn)行再水化；用3mol/L的尿素進(jìn)行消化30min，以暴露組織內(nèi)的靶點(diǎn)抗原；加檸檬酸鹽溶液進(jìn)行抗原修復(fù)；3%過(guò)氧化氫溶液避光條件下封閉30min，以消除過(guò)氧化物酶的活性；組織切片于山羊血清中封閉30min，以減少抗體與組織內(nèi)其它抗原的非特異性結(jié)合；孵育一抗，置于4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜；次日37℃水溫箱內(nèi)復(fù)溫45min；孵育二抗，37℃水溫箱內(nèi)反應(yīng)45min；加入C液，37℃條件下50min；采用DAB法顯色；蘇木素中浸泡90s，再用鹽酸酒精分化液中浸泡7s，脫水后樹(shù)膠封片。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果的判定：用光學(xué)顯微鏡放大200倍進(jìn)行免疫組化染色切片的觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)光鏡下視野進(jìn)行評(píng)分。染色面積和著色強(qiáng)度的乘積作為蛋白的免疫組化評(píng)分結(jié)果。其中染色面積的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：51%～100%的染色面積比率記為3分、11～50%的染色面積比率記為2分、1%～10%的染色面積比率記為1分、1%以下染色面積或沒(méi)有染色的記為0分。染色強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色記為0分 、弱陽(yáng)性記為1分、中等陽(yáng)性記為2分、強(qiáng)陽(yáng)性記為3分。乘積得分分別為0分、1分、2分、3分、4分、6分和9分。其中蛋白的染色結(jié)果≥ 4分者被判定為過(guò)表達(dá)，小于3分者被判定為陰性表達(dá)，介于兩者之間的被判定為弱表達(dá)。弱表達(dá)和過(guò)表達(dá)者均被認(rèn)為是陽(yáng)性表達(dá)。每張切片均由來(lái)自不同醫(yī)院的經(jīng)驗(yàn)豐富的2位病理科專家進(jìn)行雙盲觀察并打分，最終結(jié)果求其平均值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SPSS, Inc.Chicago, IL)。組織中待測(cè)蛋白在臨床病理特點(diǎn)中的表達(dá)差異采用Kruskal Wallis H(三組以上)及 Mann-Whitney U(兩組之間)檢驗(yàn)法進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。待測(cè)蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性采用Spearman秩和相關(guān)檢驗(yàn)，以r表示相關(guān)系數(shù)(以P<0.05，r>0.3定為有正相關(guān)性)。

結(jié) 果

1 NSCLC組織中Twist、Smad3、E-cadherin和Vimentin的表達(dá) Twist、Smad3、Vimentin蛋白陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色或深黃色顆粒樣(附圖A、B、D)；E-cadherin蛋白陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞膜(附圖C)。 癌組織Twist蛋白陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(P<0.001)；癌組織Smad3蛋白陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(P<0.001)；癌組織E-cadherin蛋白陽(yáng)性率顯著低于癌旁組織(P<0.001)；癌組織Vimentin蛋白陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 Twist、Smad3、E-cadherin和Vimentin在NSCLC組織樣本中的表達(dá) [n (%)]

2 Twist和Smad3在NSCLC中的表達(dá)相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，Twist與Smad3表達(dá)呈正相關(guān)，在高、中、低分化中Twist與Smad3有很好的相關(guān)性(P值均<0.001，r值均>0.459)；Twist與Smad3在TNM I-II和III-IV分期中有很好的相關(guān)性(P值均<0.01，r值均>0.806),見(jiàn)表2。

附圖 Twist、Smad3、E-cadherin和Vimentin在NSCLC中的表達(dá) (A：Twist 陽(yáng)性表達(dá)；B：Smad3陽(yáng)性表達(dá)；C：E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)；D：Vimentin陽(yáng)性表達(dá))

3 Smad3和E-cadherin、Vimentin在NSCLC中的表達(dá)相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，Smad3與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在高、中、低分化中Smad3與E-cadherin有很好的相關(guān)性(P值均<0.01，r值均<-0.335)；Smad3與E-cadherin在TNM I-II和III-IV分期中有很好的相關(guān)性(P值均<0.001，r值均<-0.471)，見(jiàn)表3。

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，Smad3與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)，在高、中、低分化中Smad3與Vimentin有很好的相關(guān)性(P值均<0.001，r值均>0.798)；Smad3與Vimentin在TNM I-II和III-IV分期中有很好的相關(guān)性(P值均<0.001，r值均>0.893)，見(jiàn)表3。

表2 Twist與Smad3在NSCLC中的表達(dá)相關(guān)性

表 3 Smad3與E-cadherin、Vimentin在NSCLC中的表達(dá)相關(guān)性

討 論

肺癌是目前國(guó)內(nèi)外發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中，NSCLC約占肺癌的85%左右[12]。腫瘤轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者生存期短的最主要問(wèn)題，但其轉(zhuǎn)移機(jī)制并不明確。只有深入研究肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，找到調(diào)控其轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶基因，并對(duì)其進(jìn)行有效的抑制，才能從根本上控制肺癌的轉(zhuǎn)移。

EMT是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)過(guò)程，也存在于多種慢性疾病的發(fā)病過(guò)程以及腫瘤形成中。其主要特征為：E-鈣黏素表達(dá)的下調(diào)、N-鈣黏素表達(dá)的上調(diào)；角蛋白為主的細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白為主的細(xì)胞骨架；以及形態(tài)上由上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)特征的細(xì)胞等。這些特征使腫瘤細(xì)胞喪失細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接，從而表現(xiàn)得更具侵襲性[13]。孫菊杰等[14]研究顯示，NSCLC中E-cadherin表達(dá)降低、Vimentin表達(dá)升高，二者的表達(dá)均與NSCLC的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期密切相關(guān)，提示EMT發(fā)生于NSCLC發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另外，還有其它學(xué)者研究表明EMT能夠參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。由此，EMT現(xiàn)象在惡性腫瘤組織中的發(fā)生是引起腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過(guò)程，但調(diào)控肺癌EMT發(fā)生的機(jī)制尚不清楚，急需深入研究。

Twist是近年來(lái)倍受關(guān)注的癌基因之一，參與EMT過(guò)程，使腫瘤細(xì)胞通過(guò)適應(yīng)周?chē)|(zhì)環(huán)境獲得新的上皮特性，形成轉(zhuǎn)移病灶，且這種轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞遷移、增殖的活性較原發(fā)腫瘤更強(qiáng)，并出現(xiàn)抗腫瘤藥物的活性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，Twist、Smad3和Vimentin在NSCLC組織中的表達(dá)明顯增加，而E-cadherin表達(dá)明顯降低。陳鯤等[17]研究了NSCLC組織中Twist、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)及其臨床意義，發(fā)現(xiàn)Twist蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織及胸腔轉(zhuǎn)移灶中過(guò)度表達(dá)，可能通過(guò)分別上調(diào)和下調(diào)Vimentin、E-eadherin的表達(dá)促進(jìn)NSCLC的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。在Twist高表達(dá)的肺癌細(xì)胞系中，Vimentin和E-eadherin的比值明顯增高，且高表達(dá)Twist的肺癌細(xì)胞系的遷移能力也顯著增強(qiáng)[18]。另外，Twist在別的腫瘤組織及癌細(xì)胞中的表達(dá)可能也與EMT相關(guān)，如胃癌組織及細(xì)胞系[19]等。但是Twist通過(guò)何種分子調(diào)控肺癌EMT發(fā)生目前并不明確。

本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示，Twist蛋白表達(dá)與Smad3在NSCLC組織中表達(dá)呈顯著正相關(guān)性，Smad3蛋白表達(dá)與Vimentin在NSCLC組織中表達(dá)呈顯著正相關(guān)性，而Smad3蛋白表達(dá)與E-cadherin在NSCLC中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性。強(qiáng)烈提示Twist可能通過(guò)TGF-β/Smad3信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC中EMT的發(fā)生。此結(jié)論與之前報(bào)道的TGF-β/SMAD3信號(hào)通路可能是誘導(dǎo)EMT發(fā)生主要的分子信號(hào)通路結(jié)論相符合[7-8]。

綜上所述，本文采用免疫組化法初步探討了NSCLC中Twist調(diào)控EMT發(fā)生的分子機(jī)制，提出了Twist可能通過(guò)TGF-β/Smad3信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC中EMT的發(fā)生這一結(jié)論，為闡明NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供依據(jù)。

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(收稿：2016-04-20)

Twist induces epithelial-mesenchymal transition in NSCLC by regulating the TGF-β/Smad3 signaling pathway Department of Thoracic Surgery,Tang Du Hospital of Foruth Military University(Xi’an710038)

Cui Kai Wang Wuping Sun Ying et al

Objective: To investigate the role of Twist which may induce EMT through TGF-β/Smad3 pathway in NSCLC, the expression of Twist, Smad3, E-cadherin and Vimentin molecules were detected and the correlations were discussed. Methods: Twist, Smad3, E-cadherin and Vimentin expressions in tumor tissues were assessed using immunohistochemical (IHC) methods in patients with resected NSCLC, and the correlation of Twist with Smad3, Smad3 with E-cadherin and Vimentin expression were analyzed. Results: The expression of Twist、Smad3、Vimentin were mainly located in cytoplasm and cell nucleus, and the expression of E-cadherin was mainly located on cell membrane. The positive expression rates of Twist, Smad3, E-cadherin and Vimentin protein in NSCLC were 72.3% (120/166), 71.1% (118/166), 54.2% (90/166), 69.9% (116/166), which were higher than corresponding adjacent non-cancerous tissue with statistical difference (P<0.001). The correlation of Twist with Smad3, Smad3 with E-cadherin and Vimentin were obvious in pathological grads and TNM stages groups in NSCLC. Conclusion: Twist may induce EMT in NSCLC by regulating the TGF-β/Smad3 signaling pathway.

Lung neoplasms/immunology @Twist genes Transforming growth factor beta Smad3 protein Stromal cells Cell line,transformed

肺腫瘤/免疫學(xué) @Twist基因 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βSmad3蛋白 間質(zhì)細(xì)胞 細(xì)胞系，轉(zhuǎn)化

R

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.007

△通訊作者