陜西省商洛市鎮(zhèn)安縣醫(yī)院神經(jīng)外科(鎮(zhèn)安711500) 李向忠 李 銀 吳德文

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蘆薈大黃素對(duì)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

陜西省商洛市鎮(zhèn)安縣醫(yī)院神經(jīng)外科(鎮(zhèn)安711500) 李向忠 李 銀 吳德文△

目的：探討蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)在體外對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、黏附、遷移和侵襲能力的影響。 方法：將體外人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分為兩組，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)AE處理(AE濃度分別為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L),同時(shí)設(shè)對(duì)照組(未經(jīng)藥物處理)。采用CCK-8法檢測(cè)AE處理后SHG44細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附能力，通過Transwell小室方法檢測(cè)AE對(duì)SHG44細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，AE處理膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞后，CCK-8法及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示AE能抑制SHG44細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系；對(duì)于細(xì)胞周期的影響主要變現(xiàn)為引起細(xì)胞發(fā)生S期阻滯；AE處理后能降低SHG44細(xì)胞的粘附能力；Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明AE處理后的SHG44細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯降低。 結(jié)論：AE能通過阻滯細(xì)胞周期于S期而抑制膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞的增殖，并且下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的黏附能力，降低細(xì)胞體外遷移及侵襲能力。

腦膠質(zhì)瘤作為難治性腫瘤之一，發(fā)病率在腦腫瘤中占40%～50%[1]，具有侵襲性強(qiáng)和易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，手術(shù)難以完全切除，藥物化療和放射治療也無法高度特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，尋求新的治療膠質(zhì)瘤的方法具有極其重要的意義。蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)作為傳統(tǒng)中藥中的一種生物活性成分,具有多方面作用[2],對(duì)腫瘤也有一定的抑制作用[3-4]。但目前有關(guān)AE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為方面的研究鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究在體外通過細(xì)胞培養(yǎng),觀察AE對(duì)體外人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44生物學(xué)行為的影響，為使用AE治療膠質(zhì)瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 細(xì)胞株及試劑 人腦膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞由西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。蘆薈大黃素(純度>95%)、DMSO試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Becton Dickinson(BD)公司，Matrigel購(gòu)自BD Biosciences公司，Transwell培養(yǎng)小室購(gòu)自Millipore公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 將膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞應(yīng)用加入10%胎牛血清及100μg/ml青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2及飽和濕度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 CCK-8法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖 選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SHG44細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度后以1×105個(gè)/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，24h后，加入不同濃度藥物，使AE終濃度為20、40、80、160μmol/L，以等體積的DMSO溶液代替藥物設(shè)置對(duì)照組，繼續(xù)孵育。用CCK-8分別測(cè)定0、24、48和72h時(shí)細(xì)胞的增殖活性。檢測(cè)前2 h，向每孔加入10μl CCK-8溶液，再在培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處各孔的吸光度值A(chǔ)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%

4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 按照上述培養(yǎng)處理方法，將對(duì)照組及AE處理組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞收集，2000 r/min離心5 min，棄上清液，加冰浴預(yù)冷的70%乙醇溶液并振蕩，4℃固定，12h后用PBS洗去殘留的乙醇，每管細(xì)胞樣品中各加入15μl碘化丙啶(PI)染色液，室溫條件下反應(yīng)20 min，上機(jī)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 將Matrigel(50μg/ml)均勻鋪于6孔板底部(100μl/孔)，對(duì)照孔加等體積1% BSA，于37℃孵育2h，棄去上清，4℃保存?zhèn)溆?。收集預(yù)先經(jīng)不同濃度AE處理24 h的SHG44細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以1×106個(gè)/孔的劑量接種于6孔板中，培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗脫3次，用胰蛋白酶消化后重新收集細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞，以3個(gè)平行復(fù)孔的平均數(shù)作為黏附細(xì)胞數(shù)，計(jì)算黏附率：黏附率(%)=黏附細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔板，用不同濃度AE培養(yǎng)48h，分別收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，將200μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出Transwell小室，洗滌，用多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15min，PBS漂洗3次，倒置光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野觀察計(jì)算小室膜下的細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算每個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)，即表示細(xì)胞的遷移能力。

7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 采用8μm孔徑、6.5mm直徑的Transwell小室，上室和下室之間以Matrigel膠和聚偏二氟乙烯(PVPF)膜模擬體內(nèi)的基質(zhì)和基底膜，其它步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，最后計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均細(xì)胞數(shù)，表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

結(jié) 果

1AE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制 經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各組的吸光度值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，表明AE在20～160μmol/L范圍內(nèi)能夠抑制SHG44細(xì)胞的增殖,呈現(xiàn)一定的劑量依賴和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系(圖1)。

圖1 不同濃度AE對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率

2AE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響 經(jīng)AE處理48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示20、40、80、160μmol/LAE處理組被阻滯于S期的細(xì)胞數(shù)量分別為(9.93±0.38)%、(15.13±0.67)%、(21.59±0.94)%和(28.69±0.59)%，均較對(duì)照組(5.24±0.48)%明顯增加(P<0.05)，各組實(shí)驗(yàn)組G0/G1期比例也略微增加，而G2/M期細(xì)胞比例則明顯減少，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。說明AE作用后可以影響膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞周期的進(jìn)程，阻斷膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖周期于S期。

3AE對(duì)SHG44細(xì)胞粘附能力的影響 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20、40、80、160μmol/L的黏附率分別為(38.24±5.16)%、(31.82±4.02)%、(23. 21±3.27)%、(14.03±3.15)%，與對(duì)照組(46.39±5.54)%比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)，說明AE處理后能抑制SHG44細(xì)胞的粘附(圖3)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度AE處理后細(xì)胞周期的變化(1：對(duì)照組；2：20μmol/L組；3：40μmol/L組；4：80μmol/L組；5：160μmol/L組)

圖3 各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞黏附率比較(*P<0.05)

4AE對(duì)SHG44 細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 各處理組在AE作用48h后進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如附表所示，AE各濃度均能減少遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中的穿膜細(xì)胞數(shù)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明AE可以降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

附表 不同濃度AE對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞遷移及侵襲的影響

討 論

腦膠質(zhì)瘤是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，盡管臨床上有手術(shù)、藥物及放化療等各種治療手段，但其病死率、復(fù)發(fā)率仍居高不下。AE是蓼科大黃屬植物中的活性成分,屬于蒽醌類物質(zhì),目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了AE在體外對(duì)胃癌[5]、甲狀腺癌[6]、乳腺癌[7]、黑色素瘤[8]和口腔癌[9]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖都有抑制作用,但是對(duì)不同的細(xì)胞系, 抗擴(kuò)增的機(jī)制并不相同[4]。楊大慶[10]報(bào)道，蘆薈大黃素通過抑制腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)合成所需的肽鏈延長(zhǎng)因子eFF-2和肽轉(zhuǎn)移酶的活性，抵制腫瘤細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)使用體外細(xì)胞模型研究了AE對(duì)SHG44細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響。研究結(jié)果顯示，AE作用于SHG44細(xì)胞后，細(xì)胞增殖速度減慢，生長(zhǎng)受到抑制，S期細(xì)胞所占比例增高，證實(shí)AE通過阻滯細(xì)胞周期于S期，減慢細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

對(duì)于不同的腫瘤類型，AE產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯的階段并不完全一樣。在胃癌SGC-7901細(xì)胞[11]及鼻咽癌細(xì)胞[12]中，AE使得細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，其機(jī)制可能涉及cyclinB1和周期蛋白依賴性激酶1(cdk1)的升高。而在人膠質(zhì)瘤U87株細(xì)胞[13]及U-373MG細(xì)胞[14]中AE阻滯細(xì)胞周期于S期，其機(jī)制則可能與蛋白激酶C(PKC)活性的抑制有關(guān)。本研究在膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞中的關(guān)于細(xì)胞周期進(jìn)程的研究結(jié)果與文獻(xiàn)基本一致，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征，癌細(xì)胞通過粘附、局部蛋白酶水解、運(yùn)動(dòng)3個(gè)步驟的反復(fù)進(jìn)行，導(dǎo)致腫瘤向深部組織侵襲及轉(zhuǎn)移。本文黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AE作用后能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞黏附基底膜的能力,既往HeTP等在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM中也發(fā)現(xiàn)AE可以顯著性抑制腫瘤細(xì)胞的黏附能力[15]。關(guān)于粘附特性在腫瘤行為中的作用，一方面，腫瘤細(xì)胞必須與原來的腫瘤組織脫粘附，才能開始侵襲，故粘附在腫瘤細(xì)胞侵襲中起抑制作用；另一方面，腫瘤細(xì)胞需要依靠粘附才能在新的部位與基底膜成分結(jié)合，形成新的轉(zhuǎn)移灶，故粘附在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。本研究顯示AE抑制SHG44細(xì)胞粘附Matrigel基質(zhì)膠，然而這種作用究竟是促進(jìn)還是抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，尚需進(jìn)一步研究。

有研究報(bào)道，用鼻咽癌[12]和乳腺癌[7]、膀胱癌[16]和卵巢癌[15]等細(xì)胞研究AE的抗腫瘤作用，結(jié)果表明AE能抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。但是，在結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中的研究與上述情況則剛好相反，即AE的作用能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力[17]。以上情況表明AE在不同的腫瘤細(xì)胞中的作用不全相同，這提示我們必須進(jìn)一步研究以明確AE在各種類型腫瘤細(xì)胞中的實(shí)際效果。

本實(shí)驗(yàn)中，筆者通過Transwell小室的實(shí)驗(yàn)方法利用細(xì)胞模型在體外證實(shí)AE具有降低膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞侵襲及遷移能力的作用。有研究證實(shí)，在鼻咽癌[12]、黑色素瘤[17]、舌癌[18]及結(jié)腸癌[19]中AE可以通過下調(diào)MMP-2及MMP-9等的表達(dá)來抑制腫瘤的遷移和侵襲。MMP-2與MMP-9是與腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的MMPs家族[20]。MMP-2 主要通過特異性降解基膜的主要成分Ⅳ、Ⅴ型膠原，對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有重要作用[21]。MMP-9 可降解多種基質(zhì)成分，破壞基膜，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[22]。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AE能通過抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、降低遷移及侵襲能力等多種途徑發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用，提示AE有望成為抗膠質(zhì)瘤藥物。當(dāng)然，體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)腫瘤組織的生物學(xué)行為存在很大差異，還需在腫瘤動(dòng)物模型上進(jìn)一步探討和驗(yàn)證，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，從而為臨床應(yīng)用AE治療膠質(zhì)瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(收稿：2016-05-23)

蘆薈大黃素/藥理學(xué) 神經(jīng)膠質(zhì)瘤/病理生理學(xué) 細(xì)胞增殖抑制或刺激藥(中藥) 體外發(fā)生 細(xì)胞遷移 抑制

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A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.006

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