中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(沈陽 110001) 孫 菁 孫明軍

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α-硫辛酸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠Th17相關(guān)炎癥因子表達(dá)影響研究*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(沈陽 110001) 孫 菁 孫明軍△

目的：探討α-硫辛酸(α-lipoic acid，ALA)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠Th17相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響。方法：將雄性Balb/c小鼠(22～25 g)隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、ALA對(duì)照組(ALA)、潰瘍性結(jié)腸炎組(UC)、ALA治療組(UC+ALA)四組，每組10只，觀察各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分，比較結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)及結(jié)直腸組織病理變化；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)小鼠血清中IL-17、IL-21分泌情況，RT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)、DAI及組織病理學(xué)評(píng)分在對(duì)照組及ALA組中無明顯差異，但在UC組中顯著升高，在UC+ALA組中明顯降低(P<0.05)；IL-17、IL-21在對(duì)照組及ALA組小鼠血清中的水平無明顯差異，但在UC組中顯著升高，在UC+ALA組中明顯降低(P<0.05)；TNF-α、TGF-β mRNA在對(duì)照組及ALA組小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)水平無明顯差異，但在UC組中顯著升高，在UC+ALA組中明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：α-硫辛酸能夠降低TNBS引起的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠IL-17、IL-21、TNF-α、TGF-β等Th17相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平，改善炎癥反應(yīng)及病理損傷。

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，如何有效緩解UC值得深入研究[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)以及免疫因素在UC發(fā)生發(fā)展過程中存在重要影響[2]。輔助性T細(xì)胞(T Helper cell，Th)17是有別于Th1及Th2的Th細(xì)胞亞群，分泌白細(xì)胞介素-17(IL-17A)等細(xì)胞因子參與UC發(fā)病[3]。α-硫辛酸(α-lipoic acid，ALA)是一種強(qiáng)效抗氧化劑，具有較好的抗氧化應(yīng)激及降低炎癥反應(yīng)作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)ALA在TNBS誘導(dǎo)的UC模型中具有保護(hù)作用，但其發(fā)揮治療作用機(jī)制尚未明確。本文在前期研究基礎(chǔ)上，探討ALA干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠過程中對(duì)Th17相關(guān)細(xì)胞因子以及炎癥反應(yīng)的影響，進(jìn)一步確定ALA在UC治療中的分子機(jī)制。

材料及方法

1 材 料 雄性BALB/c小鼠，22～25 g，由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供；三硝基苯磺酸(TNBS)、α-硫辛酸(ALA)購自Sigma(美國)；小鼠白介素-17 ELISA試劑盒、小鼠白介素-21 ELISA 試劑盒均購自博士德(武漢)；總RNA提取試劑盒購自天根生化(北京)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自百泰克(北京)；RIPA裂解液、-30 ℃低溫切片機(jī)購自Leica(德國)，體式顯微鏡購自Motic(廈門)，凝膠電泳及成像系統(tǒng)購自北京六一。

2 動(dòng)物分組及處理 將雄性Balb/c小鼠(22～25 g)共分為四組：對(duì)照組(Control)，ALA對(duì)照組(ALA)，潰瘍性結(jié)腸炎模型組(UC)，ALA治療組(UC+ALA)，每組10只。采用結(jié)腸灌注三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)建立UC模型，對(duì)小鼠禁食24 h后進(jìn)行乙醚麻醉，3 mg TNBS溶解于0.12ml乙醇，并通過長約4 cm導(dǎo)管緩慢經(jīng)小鼠肛門灌注入小鼠結(jié)腸，灌注完成后將小鼠倒立維持2～3 min；Control及ALA組灌注50%乙醇進(jìn)行假手術(shù)處理；灌注后，ALA及UC+ALA組給予80 mg/kg bw/day ALA處理，持續(xù)7 d；Control及UC組給予等體積2 %DMSO處理，持續(xù)7 d；觀察小鼠生理狀況，參考Cooper等的方法，觀察測(cè)量大鼠、精神狀態(tài)、腹瀉情況、以及體重變化，綜合評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index，DAI)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠并稱重，切除結(jié)腸組織并稱重，計(jì)算結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)(結(jié)腸質(zhì)量/體重)。收集結(jié)腸組織凍存或固定用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 病理切片HE染色觀察 對(duì)各組小鼠同一結(jié)腸區(qū)域組織進(jìn)行甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，對(duì)根據(jù)HDS炎癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組切片進(jìn)行組織損傷學(xué)評(píng)分[4]。對(duì)病理切片進(jìn)行觀察，200倍光鏡下，隨機(jī)選取8個(gè)視野進(jìn)行觀察和評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：視野中正常腸粘膜記為0分；缺少1/3隱窩記為1分，缺少2/3隱窩記為2分；上皮層保持完整，存在少量炎癥細(xì)胞浸潤，記為3分；黏膜層、黏膜下層以及肌層炎癥細(xì)胞增多且明顯存在炎癥細(xì)胞浸潤，隱窩及上皮層均消失，記為4分。對(duì)8個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分后取平均值作為該組樣本總的組織病理學(xué)評(píng)分。

4 ELISA檢測(cè)血清樣本中IL-17、IL-21水平 取各組小鼠血清適當(dāng)稀釋，并對(duì)L-17及IL-21標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，參照ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀450nm波長檢測(cè)各組吸光值OD450，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清樣本中細(xì)胞因子IL-17、IL-21濃度，每樣本檢測(cè)6次，取均值計(jì)算。

5 RT(逆轉(zhuǎn)錄)-PCR檢測(cè)TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)情況 收集各組小鼠結(jié)腸黏膜組織樣本，利用總RNA提取試劑抽提各組小鼠結(jié)腸黏膜組織RNA，經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)合成cDNA第一鏈，加入相應(yīng)檢測(cè)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)TNF-α、TGF-β 基因mRNA表達(dá)水平，根據(jù)NCBI提供基因序列信息設(shè)計(jì)，TNF-α上游引物序列： 5’- GAGTCCGGGCAGGTCTACTT -3’；TNF-α下游引物序列： 5’- CCAGGTCACTGTCCCAGCATC -3’；TGF-β上游引物序列： 5’-GCCAGATCCTGTCCAAACTA-3’；TGF-β下游引物序列： 5’-GTTGTTGCGGTCCACCATTA-3’；以β-actin為內(nèi)參基因，其上游引物序列為： 5’-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’； β-actin下游引物序列為：5’- GATGTCACGCACGATTTCC -3’；設(shè)置PCR反應(yīng)條件為：95℃，預(yù)變性3 min；95℃，變性30 s；58 ℃，退火30 s；72℃，延伸30 s；循環(huán)數(shù)30。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，掃描分析光密度值，計(jì)算TNF-α、TGF-β對(duì)β-actin的相對(duì)表達(dá)量。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±sd)表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；P<0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 小鼠結(jié)腸炎活動(dòng)程度評(píng)估 Control組及ALA對(duì)照組小鼠飲食正常、精神狀態(tài)良好，大便性狀未改變，體重略有增加，結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)無明顯變化；UC組小鼠造模給藥后，逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)、厭食、腹瀉便血，體重減輕，結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)增加，DAI評(píng)分顯著上升(P<0.05)；而在UC+ALA治療組，進(jìn)行ALA干預(yù)后，相比UC組，小鼠厭食情況有所減輕，體重下降程度減緩，便血逐漸減少或隱血，結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)下降，DAI評(píng)分有所下降(P<0.05)。提示ALA對(duì)TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎具有一定保護(hù)作用。

表1 各組小鼠結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)及DAI評(píng)分

2 小鼠腸粘膜組織學(xué)病理情況變化 HE染色結(jié)果顯示，Control及ALA組小鼠結(jié)腸組織黏膜表面光滑，未見明顯充血及炎性水腫，肌層完整；UC組小鼠經(jīng)TNBS誘導(dǎo)后，小鼠結(jié)腸黏膜組織高度充血水腫，上皮細(xì)胞損傷脫落，出現(xiàn)間斷性潰瘍面，結(jié)腸厚度增加，黏膜中存在大量炎性細(xì)胞浸潤，肌層完整性受到破壞，病理評(píng)分顯著升高；UC+ALA組小鼠腸粘膜充血水腫癥狀相對(duì)UC模型組明顯減輕，潰瘍程度減低，炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕，有輕微滲出，病理評(píng)分相比UC組降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察(HE，200×)

表2 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

3 血清IL-17、IL-21水平變化 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-17及IL-21在Control及ALA組小鼠血清中含量無明顯差異，但在UC組中水平明顯上調(diào)(P<0.05)，而經(jīng)ALA干預(yù)，UC+ALA組，與UC模型組比較，IL-17與LI-21水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 結(jié)腸黏膜TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)情況 Control組與ALA組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)水平無顯著差異；與Control組比較，UC模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、TGF-β表達(dá)有所增加，存在顯著差異，而ALA干預(yù)后，UC+ALA組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、TGF-β表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

表3 各組小鼠血清IL-17、IL-21含量比較(pg/ml)

圖2 結(jié)腸粘膜組織中TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)(A：RT-PCR檢測(cè)結(jié)腸粘膜TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)；B：結(jié)腸粘膜TNF-α、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量；與Control組比較，a P<0.05；與UC組比較，b P<0.05)

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是炎癥性腸病(IBD)的一種，以結(jié)直腸黏膜及黏膜下炎癥病變及潰瘍?yōu)橹饕碚鳎袗鹤兊奈ｋU(xiǎn)。全球范圍內(nèi)，流行病學(xué)研究顯示UC的患病率成逐漸上升趨勢(shì)。目前臨床治療UC主要采用氨基水楊酸類、免疫抑制劑抗生素類、以及激素類等傳統(tǒng)藥物，但均具有一定程度副作用，開發(fā)新的藥物及治療靶點(diǎn)仍然是UC治療的研究焦點(diǎn)。α-硫辛酸(ALA)是一種公認(rèn)的全能天然抗氧化劑，不僅能夠直接清除自由基，同時(shí)還可以促進(jìn)其他抗氧化劑再生，對(duì)于急慢性炎癥均有良好的抗炎功效。目前α-硫辛酸(ALA)對(duì)UC的保護(hù)作用研究還處于起步階段，相關(guān)分子機(jī)制仍需要深入探討[5]。筆者前期通過研究發(fā)現(xiàn),ALA能夠抑制TNBS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中氧化應(yīng)激反應(yīng)以及MAPK信號(hào)通路活化，抑制細(xì)胞凋亡，減少組織損傷，另有報(bào)道指出MAPK及STAT3信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞分化[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討在ALA對(duì)UC模型作用過程中Th17相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)及分泌的影響。

本研究結(jié)果顯示，Control組及ALA對(duì)照組小鼠生理狀態(tài)良好，而UC組小鼠造模給藥后，逐漸出現(xiàn)精神萎靡、厭食、體重逐漸減輕，腹瀉便血，結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)增加，DAI評(píng)分顯著上升，結(jié)腸組織病理評(píng)分顯著升高；而在UC+ALA治療組，進(jìn)行ALA干預(yù)后，相比UC組，小鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，厭食減輕，體重下降減少，便血輕微或隱血，結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)下降，DAI評(píng)分有所下降，結(jié)腸組織病理評(píng)分有所降低，提示ALA能夠抑制TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎病情進(jìn)展。

Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種Th1、Th2之外新的Th細(xì)胞亞群，以特征性分泌IL-17而得名，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生。有研究認(rèn)為，UC的發(fā)生與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、Th17細(xì)胞之間的平衡破壞存在密切關(guān)聯(lián)[7]。上調(diào)DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中IL-10水平，能夠促進(jìn)Treg細(xì)胞分化而降低Th17細(xì)胞比例，重建Treg/Th17平衡，降低IL-17、IL-6、IL-23等炎癥因子水平，從而改善潰瘍性結(jié)腸炎癥反應(yīng)[7]。IL-17是Th17細(xì)胞特異性分泌的細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性，是體內(nèi)強(qiáng)效的炎癥因子之一，能夠誘導(dǎo)促炎癥因子IL-6、TNF-α等表達(dá)，參與組織炎癥進(jìn)展，與多種自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病以及炎癥性腸病等密切相關(guān)。除了IL-17以外，Th17細(xì)胞還分泌其他一些炎癥因子包括TNF-α、IL-21、IL-22等，進(jìn)而活化中性粒細(xì)胞使之募集至炎癥部位，介導(dǎo)前炎癥反應(yīng)[8]。Th17分化主要受到IL-6、IL-21、TGF-β等的調(diào)節(jié)作用。TGF-β是Th17細(xì)胞分化的重要因子之一，IL-21由Th17細(xì)胞大量自分泌后，與TGF-β協(xié)調(diào)作用，進(jìn)一步作用于Th17細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞向Th17亞群分化[9]。大量研究表明，UC患者血清中IL-17水平顯著上升[10]。TNF-α作為一種重要的促炎癥因子，能夠促進(jìn)其他炎癥因子釋放，進(jìn)而放大炎癥反應(yīng)，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子表達(dá)水平，增加腸道通透性以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)加重腹瀉，參與UC炎癥反應(yīng)過程以及免疫應(yīng)答，在UC發(fā)病過程以及病程進(jìn)展過程中扮演重要角色[11]。研究表明，TNF-α在UC發(fā)病期間表達(dá)水平顯著上升，與UC發(fā)生及發(fā)展具有重要關(guān)聯(lián)[12]。

本實(shí)驗(yàn)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-17及IL-21在Control及ALA組小鼠血清中含量無明顯差異，但在UC組中水平明顯上調(diào)，而經(jīng)ALA干預(yù)后，IL-17與LI-21水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)水平在Control組與ALA組小鼠結(jié)腸組織中無顯著差異，而在UC模型組小鼠結(jié)腸組織中表達(dá)顯著增加，經(jīng)ALA干預(yù)后，UC+ALA組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、TGF-β表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明ALA可能通過抑制TGF-β及IL-21表達(dá)抑制Th17細(xì)胞分化，并通過反饋調(diào)節(jié)進(jìn)一步抑制IL-17、 TNF-α以及IL-21等炎癥因子的表達(dá)分泌，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)組織損傷修復(fù)，起到治療UC的作用。

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(收稿：2016-04-27)

Effect of alpha acid-lipoic on the expression of Th17 related inflammatory factors in mice with ulcerative colitis Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital，China Medical University

(Shenyang 110001) Sun Jing Sun Mingjun

Objective: To investigate the effect of α-lipoic acid (ALA) on the expression of Th17 related inflammatory factors in mice with ulcerative colitis. Methods: The Balb/c mouse model with ulcerative colitis was induced by three sulfonic acid trinitrobenzene (TNBS). Male Balb/c mice (22～25 g) were divided into four groups, with control group (Control), ALA control group (ALA), ulcerative colitis group (UC), and ALA in the treatment of ulcerative colitis group (UC+ALA),10 mice in each group. The colonic mass index, the disease activity index (DAI) and the pathological score of HE (HDS) in each group were calculated. The secretion of IL-17 and IL-21 in mice serum was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The autophagy gene TNF-α, TGF-β mRNA level was detected by RT-PCR. Results: There was no significant difference between Control group and ALA group in the quality index, DAI and histopathology score, but it was significantly increased in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). There was no significant difference between IL-17 and IL-21 in Control group and ALA group of mice serum levels, but increased significantly in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). There was no significant difference in the expression levels of TNF-α, TGF-β mRNA and in Control group and ALA group, but significantly increased in the UC group, and significantly lower in the UC+ALA group (P<0.05). Conclusion: The α-lipoic acid can reduce the expression levels of IL-17, IL-21, TNF-α, TGF-β and other Th17 related inflammatory factors in ulcerative colitis mice induced by TNBS, and improve the inflammation, as well as promote pathological damage repair.

Colitis,ulcerative/immunology Thioctic acid @Th17 cells Inflammation mediators Mice

*遼寧省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013020198-202)

結(jié)腸炎,潰瘍性/免疫學(xué) 硫辛酸 @輔助性T細(xì)胞17 炎癥介導(dǎo)素類 小鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.003

△通訊作者