王 迪，羅 音，高亞敏，趙燕燕，鄒春靜

(華東師范大學生命科學學院，上海 200241)

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外施海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗膜脂過氧化的影響

王 迪，羅 音，高亞敏，趙燕燕，鄒春靜

(華東師范大學生命科學學院，上海 200241)

冬小麥；高溫脅迫；活性氧；海藻糖；抗氧化系統(tǒng)

海藻糖(Trehalose)是由兩個葡萄糖分子通過α,α-1,1糖苷鍵結合而成的可溶性非還原性糖，在許多生物體中廣泛存在。海藻糖對熱、pH 等不敏感，在高溫、干旱、寒冷、高鹽堿等逆境條件下可保護生物膜、蛋白質(zhì)等免受傷害[4，8]。植物中的海藻糖還參與代謝調(diào)控和基因表達調(diào)控，對植物的生長發(fā)育及響應外界環(huán)境變化有重要影響[9]。許多微生物、低等動、植物在遭受不良生活環(huán)境時，通過體內(nèi)調(diào)節(jié)合成海藻糖以抵御逆境脅迫。外源添加海藻糖也能較好保護細胞、生物體和生物大分子。研究表明，在高溫、干旱、高鹽等脅迫條件下，外源海藻糖可以維持作物相對正常的生長[10-12]。葉施海藻糖可提高植物酶促機制中POD和CAT活性及非酶抗氧化劑AsA的含量，減輕干旱脅迫條件下的氧化損傷[10]。用根施海藻糖的方法提高小麥的海藻糖含量，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下，外源海藻糖可以影響膜脂組成，從而穩(wěn)定類囊體膜[11]。但高溫脅迫及室溫恢復期的小麥幼苗中，外源海藻糖是否通過影響抗氧化系統(tǒng)來提高膜脂的穩(wěn)定性未見報道。本研究以冬小麥為實驗材料，在苗期進行海藻糖和40 ℃高溫脅迫處理，探究在高溫脅迫條件下，外源海藻糖減輕小麥幼苗氧化脅迫損傷的機理，以期為作物大田生產(chǎn)應對高溫脅迫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

挑選完整飽滿的小麥(TriticumaestivumL.)籽粒(品系寧-13)，用0.01 %(m/v) HgCl2溶液浸泡12 h后，再用清水清洗2～3遍，加入適量清水后放在培養(yǎng)箱中催芽24 h，挑選發(fā)芽狀況基本一致的小麥種子均勻排在特制帶有漏網(wǎng)的塑料培養(yǎng)盤中，加入適量清水，放在室溫下管理，待小麥幼苗長至一葉一心時期開始澆灌Hoagland營養(yǎng)液,培養(yǎng)期間每天更換清水或者Hoagland營養(yǎng)液。

1.2 高溫脅迫處理

當小麥幼苗的第三片葉子開始伸展時，用1.5 mmol·L-1的海藻糖營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d(TRE)，并以不加海藻糖的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)小麥幼苗為對照(CK)，然后放入光照培養(yǎng)箱高溫(40 ℃；光強 120 μmol·m-2·s-1；濕度38%)處理24 h(晝13 h，夜11 h)。高溫處理結束后將小麥幼苗移至室溫條件下繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)72 h。取小麥第二片伸展葉進行指標的測定。

1.3 丙二醛(MDA)含量的測定

MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法，分別測定532 nm、600 nm和450 nm波長下的吸光度[13]。

1.5 抗氧化酶的提取和活性測定

取新鮮小麥幼苗第二片伸展葉0.5 g，置于預冷后的研缽中，然后加入已經(jīng)預冷的0.05 mol·L-1Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.8)緩沖液5 mL，充分研磨至勻漿。過濾后在4 ℃，12 000 r·min-1的條件下離心20 min。SOD和APX活性的測定參考Cakmak等的方法[16]；CAT活性的測定參考Durner等的方法[17]；POD活性的測定參考Andres等的方法[18]。

1.6 非酶促抗氧化物質(zhì)含量的測定

取新鮮小麥幼苗第二片伸展葉0.5 g，置于預冷后的研缽中，然后加入已經(jīng)預冷的6%偏磷酸緩沖液3 mL(含有1 mmol·L-1EDTA，pH 2.8)和少量的石英砂，充分研磨至勻漿。在4 ℃、10 000 r·min-1的條件下離心20 min，取上清液測定。參考Anderson等的方法測定還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量[18]。還原型抗壞血酸(AsA)的提取測定參考Law等[19]的方法：取新鮮小麥幼苗第二片伸展葉0.5 g，置于預冷后的研缽中，然后加入已經(jīng)預冷的5%(w/v)的磺基水楊酸2.5 mL和少量的石英砂，充分研磨至勻漿4 000 r·min-1離心10 min，取上清液測定。

1.7 抗氧化酶Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、POD和APX基因RNA提取和RT-Q-PCR檢測

根據(jù)制造商的說明，使用RNAiso Plus(Takara, Japan)提取RNA。500 ng RNA作為模板與Sso Advanced TM SYBR○RGreen Super-mix(Bio-Rad)共同用于SuperScript One-step RT-PCR，在實時定量PCR儀(CFX96, Bio-Rad, USA)上進行反應。RT-PCR反應步驟：cDNA的構建體在25 ℃下5 min，然后在42 ℃下， 85 ℃下5 min；隨后qRT-PCR的擴增譜在95 ℃下3 s，然后在95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 5 s進行39個循環(huán)。轉錄水平以18S rRNA(TTAGTTGGT GGAGCGATTT，AACCAGCGACCTACAACG)為內(nèi)參基因。

1.8 數(shù)據(jù)分析方法

所用指標測定均有3次或3次以上的重復，實驗結果是3次或3次以上平均值±SD。統(tǒng)計分析利用DPS軟件(浙江大學，中國)，按照采用單因素或雙因素進行方差分析。利用Excel 2003軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 外源海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗葉片丙二醛(MDA)含量的影響

經(jīng)過高溫脅迫后，海藻糖處理和CK的MDA含量均顯著升高(圖1)，說明高溫脅迫對脂膜造成了損傷。室溫恢復過程中海藻糖處理的MDA含量與CK變化趨勢基本相同，均表現(xiàn)為先升后降。由于高溫脅迫導致ROS過量產(chǎn)生，從而引起MDA的積累，而抗氧化系統(tǒng)不能完全清除ROS，因而室溫恢復前期MDA含量繼續(xù)上升，隨著室溫恢復時間的延長及抗氧化系統(tǒng)的誘導， ROS的清除能力增強，使室溫恢復后期MDA含量降低。在高溫脅迫及室溫恢復過程中，海藻糖處理的MDA含量均顯著低于CK，說明外源海藻糖降低了ROS產(chǎn)生引起的脂膜過氧化，保護了膜結構的穩(wěn)定性。

TRE：海藻糖處理；H0：高溫處理前；H24：高溫脅迫24 h；R12、R24、R36、R48、R72分別代表高溫處理后室溫恢復了12 h、24 h、36 h、48 h和72 h。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

TRE:Trehalose pretreatment; H0:Without high temperature treatment; H24:High temperature treatment for 24 h; R12,R24,R36,R48 and R72 represent different treatments recovered 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 72 h from high temperature treatment, respectively. Different letters show significant differences(P<0.05). The same as in the other figures.

圖1 外源海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗葉片丙二醛(MDA)含量的影響

Fig.1 Influences of exogenous trehalose on MDA content of wheat seedling leaves under heat stress

2.3 外源海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

在經(jīng)過24 h高溫脅迫和室溫恢復后，海藻糖處理和CK的SOD活性均呈先降后升的趨勢，且室溫恢復24 h后海藻糖處理的SOD活性持續(xù)低于CK(圖3A)。

在經(jīng)過24 h高溫脅迫后，CK的CAT活性無顯著性變化，而海藻糖處理的CAT活性上升53.85%，顯著高于CK(P<0.05)(圖3B)，說明海藻糖在高溫脅迫條件下增加了CAT活性。室溫恢復12 h后，海藻糖處理的CAT活性降低，而CK的CAT活性顯著上升，但經(jīng)過更長時間的室溫恢復后，海藻糖處理的CAT活性與CK均無顯著性差異。

在正常生長條件、高溫脅迫條件及室溫恢復至24 h期間，海藻糖處理的POD活性與CK無顯著性差異(圖3C)。而室溫恢復36 h、48 h、72 h后，海藻糖處理的POD活性分別上升40.87%、67.00%、70.74%，均顯著高于CK(P<0.05)。表明海藻糖可能在高溫脅迫后的室溫恢復后期階段增強了POD的活性。

在經(jīng)過24 h高溫脅迫及隨后的常溫室溫恢復12 h、24 h、36 h后，海藻糖處理的APX活性顯著高于CK(圖3D，P<0.05)，表明海藻糖在高溫脅迫條件下提高了APX活性。而經(jīng)過較長時間的48 h、72 h室溫恢復后，海藻糖處理的APX活性與CK無顯著性差異。

由上述結果可知，與CK相比，在高溫脅迫后和室溫恢復前期(12 h)外源海藻糖增強了APX活性，引起CAT活性急劇上升后降低，室溫恢復中后期(24 h、36 h、48 h、72 h)主要提高了POD和APX活性，抑制了SOD活性。說明海藻糖可能通過調(diào)控這些抗氧化酶在高溫及室溫恢復階段的活性以響應高溫脅迫。

2.4 外源海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗葉片非酶促系統(tǒng)AsA含量和GSH/GSSG比值的影響

在高溫脅迫及室溫恢復過程中，雖然CK和海藻糖處理的還原型與氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)沒有顯著差異(圖4A)，但高溫脅迫及室溫恢復中后期(36 h、48 h、72 h)，海藻糖處理的AsA含量明顯高于CK(圖4B)。

2.5 外源海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗葉片抗氧化酶基因表達的影響

常溫下外源海藻糖顯著上調(diào)了所有抗氧化酶基因的表達量(圖5)。在高溫脅迫下，CK的Mn-SOD和CAT基因的相對表達量沒有顯著變化，而Cu/Zn-SOD、POD、APX基因均顯著上調(diào)表達；與CK相比，外源海藻糖處理的小麥幼苗中，CAT基因相對表達量沒有顯著變化，Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、 POD、APX的基因相對表達量均顯著上調(diào)，表達量分別是CK的4.37、1.90、2.38和 1.39倍。室溫恢復了24 h后，外源海藻糖處理的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、POD和APX的基因相對表達量均顯著高于CK，分別是CK的4.37、2.12、1.69、10.19和2.14倍。這些結果表明在高溫脅迫下(CAT基因除外)和室溫恢復條件下，海藻糖使小麥幼苗Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、POD和APX的基因發(fā)生明顯上調(diào)表達。

圖2 外源海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗葉片產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

圖3 外源海藻糖對高溫脅迫下幼苗期小麥葉片中抗氧化酶SOD(A)、CAT(B)、POD(C)、APX(D)活性的影響

圖4 外源海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗葉片非酶促系統(tǒng)GSH/GSSG比值(A)和AsA含量(B)的影響

圖5 外源海藻糖對高溫脅迫下小麥幼苗葉片抗氧化酶基因Mn-SOD(A)、Cu/Zn-SOD(B)、CAT(C)、POD(D)和APX(E)基因相對表達量的影響

3 討 論

高溫脅迫會導致植物體中ROS過量產(chǎn)生。ROS可以破壞膜的結構、組成和功能，導致膜滲漏和選擇透過性受損[2]，使膜脂過氧化，產(chǎn)生毒害更大的氧化產(chǎn)物MDA，因此常用MDA的累積表示膜脂過氧化程度。本研究結果表明，高溫脅迫及隨后的室溫恢復過程，海藻糖處理的小麥幼苗MDA含量均顯著低于CK(圖1)，說明海藻糖處理降低了高溫脅迫造成的脂質(zhì)過氧化程度，維持膜的穩(wěn)定性，能夠對高溫脅迫下小麥幼苗葉片的細胞膜起到保護作用。

在常溫條件、高溫脅迫和室溫恢復條件下，海藻糖處理的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、POD和APX基因的相對表達量均顯著高于CK，表明海藻糖處理提高了Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、POD和APX這些抗氧化酶的含量，從而提高抗氧化系統(tǒng)的活性，促進小麥幼苗清除有害的ROS，維持相對正常的生理機能。海藻糖處理后的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD相對表達量上調(diào)(圖5A)，而SOD活性沒有顯著變化甚至在室溫恢復后期降低(圖3A)，與之前的報道相似[24]，可能是因為高溫脅迫下Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的翻譯水平較低所致。

AsA-GSH循環(huán)在清除H2O2的抗氧化代謝起著重要作用。在AsA-GSH循環(huán)中，首先，APX利用AsA將H2O2還原成H2O的同時也形成單脫氫抗壞血(MDHA)，MDHA很不穩(wěn)定，其中一部分被單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)還原為AsA，另一部分被進一步氧化后生成脫氫抗壞血酸(DHA)。DHA以還原型谷胱甘肽(GSH)為底物，在脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)的作用下生成 AsA。此反應產(chǎn)生的氧化型谷胱甘肽(GSSG)又可在谷胱甘肽還原酶(GR)的催化下被還原成GSH。在葉綠體中清除活性氧的關鍵抗氧化物質(zhì)是AsA[25]，它是植物和大多數(shù)動物體內(nèi)一種重要的抗氧化劑。AsA和GSH通過維持植物細胞和組織中的氧化還原狀態(tài)，直接清除ROS以保護植物。GSH/GSSG比值是一種氧化脅迫狀態(tài)的動態(tài)指標，可反映對逆境的抵抗能力[26]。高溫脅迫下GSH/GSSG比值沒有顯著變化，但外源海藻糖處理維持了較高的AsA含量，表明外源海藻糖處理提高了AsA含量，增強對H2O2的清除并降低其含量，緩解了氧化脅迫造成的損傷，從而提高了小麥幼苗對高溫的耐受性。

總之，外源海藻糖能夠提高Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶的基因的相對表達量，增加高溫脅迫下小麥幼苗葉片抗氧化酶CAT和APX活性以及室溫恢復期的POD和APX活性和抗氧化物質(zhì)AsA的含量，增強清除ROS的能力，從而減少MDA累積，增強高溫脅迫條件下膜脂穩(wěn)定性，提高小麥幼苗對高溫脅迫的抗性。

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Effects of Exogenous Trehalose on the Membrane Lipid Peroxidation in Wheat Seedlings under Heat Stress

WANG Di,LUO Yin,GAO Yamin,ZHAO Yanyan,ZOU Chunjing

(East China Normal University, School of Life Science, Shanghai 200241，China)

Winter wheat; Heat stress; Reactive oxygen species; Trehalose; Antioxidant system

時間：2016-07-07

2015-12-26

2016-01-24

國家自然科學基金項目(31200301)

E-mail：wdlsyg@163.com

鄒春靜(E-mail:cjzou@bio.ecnu.edu.cn)

S512.1；S311

A

1009-1041(2016)07-0925-08

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1531.028.html