田小超，何偉亮，劉斯文，楊 蓉，劉素云*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050051；3.河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)情報(bào)研究所查新室，河北 石家莊 050071)

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·論 著·

丁苯酞注射液對(duì)小鼠的急性毒性和慢性毒性試驗(yàn)研究

田小超1，何偉亮2，劉斯文3，楊 蓉1，劉素云1*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050051；3.河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)情報(bào)研究所查新室，河北 石家莊 050071)

目的觀察丁苯酞注射液的急性毒性和長(zhǎng)期毒性。方法采用Bliss法觀察丁苯酞注射液對(duì)C57BL/6小鼠的急性毒性；連續(xù)30 d尾靜脈重復(fù)給藥，觀察其對(duì)小鼠的長(zhǎng)期毒性，分為丁苯酞注射液低、中、高3個(gè)劑量組(分別為40、80、160 mg/kg) 和生理鹽水對(duì)照組，對(duì)一般生理指標(biāo)、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血清尿素氮、血清肌酐和組織病理學(xué)進(jìn)行檢查。 結(jié)果急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示丁苯酞注射液對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為545.1 mg/kg；連續(xù)30 d 尾靜脈重復(fù)給藥的慢性毒性結(jié)果顯示僅高劑量組天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，其他生化指標(biāo)、動(dòng)物攝食量和體質(zhì)量、臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢查與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論合理使用丁苯酞注射液不會(huì)對(duì)靶動(dòng)物產(chǎn)生不良反應(yīng)。

毒性試驗(yàn)；丁苯酞注射液；小鼠

丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)為近幾年來(lái)我國(guó)自主研發(fā)的國(guó)家Ⅰ類新藥[1]。臨床上已經(jīng)被列為急性腦梗死診治指南的指導(dǎo)用藥[2]。但有關(guān)NBP的不良反應(yīng)時(shí)有報(bào)道，主要表現(xiàn)為肝功能異常、胸悶、皮炎和胃腸道反應(yīng)等[3-5]。隨著NBP引起不良反應(yīng)報(bào)道的日益增多，其安全性問(wèn)題逐漸引起人們的關(guān)注。為探究NBP潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，提高其安全性和質(zhì)量可控性，本研究應(yīng)用C57BL/6小鼠對(duì)其進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，以觀察NBP產(chǎn)生的毒性反應(yīng)癥狀和嚴(yán)重程度，旨在為NBP的安全性再評(píng)價(jià)提供重要的毒理學(xué)資料，也為臨床安全用藥及預(yù)防不良反應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品、動(dòng)物與儀器 丁苯酞注射液(dl-3-n-butyphthalide，NBP，商品名：恩必普)由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)提供，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20100041。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量20～25 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)： SCXX(京) 2006-0009。7020 全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)。

1.2 研究方法 按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的相關(guān)指導(dǎo)原則要求實(shí)施[6]。

1.2.1 小鼠經(jīng)靜脈給藥急性毒性試驗(yàn) 采用Bliss法，60只小鼠，體質(zhì)量20～25 g，分為6組，每組10只，單次靜脈注射NBP溶液。根據(jù)少量小鼠進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)結(jié)果得到NBP的半數(shù)致死量(medial lethal dose,LD50)為630 mg/kg，故正式試驗(yàn)中NBP劑量分別為384.1、429.4、480.1、536.7、600.0、670.8 mg/kg，給藥體積按0.02 mL/g，速度<0.5 mL/min，觀察給藥后小鼠出現(xiàn)中毒的癥狀和時(shí)間、表現(xiàn)程度以及小鼠死亡前的特征和死亡時(shí)間，并且對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，觀察主要臟器的改變。觀察期為2周。

1.2.2 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn) 分別設(shè)NBP 低、中、高(40、80、160 mg/kg)3個(gè)劑量組和對(duì)照(0.9%生理鹽水)組， 每組10只小鼠。均為尾靜脈注射給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥30 d。

1.3 觀察指標(biāo) ①一般生理指標(biāo)：記錄死亡小鼠數(shù)，并及時(shí)了解其死亡原因，觀察存活小鼠的精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、糞便性狀等狀況。每3天測(cè)量體質(zhì)量和攝食量。②檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)：小鼠最后一次給藥24 h后，心臟采血，應(yīng)7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量血清ALT和AST含量。③檢測(cè)血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)：應(yīng)用7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量血液中BUN和SCr的變化。④組織病理學(xué)檢查:小鼠經(jīng)解剖尸體后稱取各臟器質(zhì)量。一部分心臟、肝臟和腎臟置于10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠經(jīng)靜脈給藥急性毒性試驗(yàn) 60只小鼠分別以384.1、429.4、480.1、536.7、600.0、670.8mg/kg靜脈注射NBP溶液后，均出現(xiàn)了輕微到嚴(yán)重的毒性反應(yīng), 直至死亡。 主要的毒性反應(yīng)為嘔吐, 呼吸急促,自發(fā)活動(dòng)減少，頭部及四肢顫抖、痙攣等反應(yīng)。≥480.1mg/kg的劑量組中的部分小鼠出現(xiàn)呼吸深慢、口鼻發(fā)紺、無(wú)自發(fā)活動(dòng)等瀕死癥狀，給藥后3～20min內(nèi)死亡，死亡發(fā)生率隨劑量增加而增加，6個(gè)劑量組依次為0、0、10%、40%、80%、100%，死亡小鼠無(wú)明顯的性別差異，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行尸解，未死亡小鼠在給藥30min后逐漸恢復(fù)正常。14d觀察期內(nèi)存活小鼠體質(zhì)量未見(jiàn)明顯變化，籠旁觀察未見(jiàn)明顯異常，觀察期結(jié)束時(shí)對(duì)小鼠麻醉后進(jìn)行大體解剖，小鼠主要臟器心、腦、肺、肝、腎等無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。

小鼠經(jīng)靜脈注射NBP的LD50為545.1mg/kg，LD50的95%可信區(qū)間為511.5～578.7mg/kg，見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠靜脈注射NBP的劑量與死亡率的關(guān)系

Figure 1 The relationship between the intravenous NBP dose and the mortality rate in mice

2.2 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)觀測(cè)指標(biāo)結(jié)果 給藥期間NBP各劑量組中均未出現(xiàn)小鼠死亡，但在首次給藥后出現(xiàn)少動(dòng)、步態(tài)不穩(wěn)、 俯臥等現(xiàn)象，0.5～2 h后逐漸得到恢復(fù)，高劑量組在給藥后還出現(xiàn)抽搐、狂躁不安等癥狀，其他未見(jiàn)明顯異常。給藥30 d后各組體質(zhì)量，攝食量，血清ALT、BUN、SCr差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NBP高劑量組AST值較對(duì)照組升高(P<0.05)，而低、中劑量組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NBP給藥30 d后對(duì)各組觀察指標(biāo)的影響

Table 1 The effect of NBP on observation indexes in different groups on day 30 post-administration

組別體質(zhì)量(g)攝食量(g)ALT(U/L)AST(U/L)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)對(duì)照組 30.2±3.221.0±1.929.2±3.994.6±13.85.3±0.692.8±9.6低劑量組29.6±2.821.1±2.130.8±4.2102.6±16.45.2±0.796.5±10.8中劑量組28.9±3.121.4±2.133.5±5.1118.8±16.25.5±0.5101.2±9.9高劑量組29.3±2.622.0±1.635.3±8.7139.6±15.5*5.8±0.9105.6±19.3F0.3470.6032.17816.3081.4021.827P0.7910.6170.1080.0000.2580.160

*P<0.05與對(duì)照組比較(q檢驗(yàn))

2.3 病理組織學(xué)檢查 小鼠經(jīng)靜脈連續(xù)給藥30 d后，肉眼大體觀檢查各劑量組小鼠主要臟器的形態(tài)、外觀與對(duì)照組比較，未見(jiàn)明顯異常，臟器系數(shù)未見(jiàn)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)改變。病理學(xué)檢查方面，與對(duì)照組相比，各劑量組小鼠的心臟、肝臟和腎臟的組織未見(jiàn)明顯的病理學(xué)改變。

3 討 論

腦卒中是全球引起死亡的第二大疾病，僅次于心臟病，約全球總病死人數(shù)的11.13%[7]，其發(fā)病率是隨年齡增長(zhǎng)而明顯上升的。在我國(guó)，腦卒中患病率為260～719/10萬(wàn)人，類似于發(fā)達(dá)國(guó)家[8]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外經(jīng)循證醫(yī)學(xué)證實(shí)能夠有效治療缺血性腦卒中急性期的口服藥物非常有限，僅有阿司匹林和氯吡格雷。因此，研究新的治療缺血性腦血管病成為亟需解決的問(wèn)題。NBP是一類新型抗腦缺血的藥物，能夠影響腦缺血的多個(gè)病理生理過(guò)程，具有神經(jīng)保護(hù)、抗血小板凝集、促進(jìn)血管再通等作用。研究顯示NBP對(duì)輕至中度的腦缺血患者的臨床有效率高達(dá)70%以上[9]。盡管在2005年NBP作為治療缺血性腦卒中的藥物，獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)并上市，但近年來(lái)有關(guān)NBP引起的不良反應(yīng)報(bào)道增多。因此，對(duì)其進(jìn)行安全再評(píng)價(jià)顯得尤為重要。

急性毒性試驗(yàn)可確定藥物中毒的作用方式和反應(yīng)情況，并且可以為慢性毒性試驗(yàn)觀察指標(biāo)及劑量分組提供重要的參考依據(jù)[10]。本研究著重考察了小鼠靜脈注射NBP的急性毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠靜脈注射NBP的LD50為545.1 mg/kg， 大約為有效劑量(小鼠腦缺血模型的有效劑量為 20 mg/kg[11])的25倍以上，給藥后存活小鼠僅出現(xiàn)一過(guò)性自發(fā)活動(dòng)減少、俯臥少動(dòng)等癥狀。表明NBP具有較高的安全性。

慢性毒性試驗(yàn)則可以深入評(píng)價(jià)毒物的毒性強(qiáng)度[12]。NBP導(dǎo)致的肝功能異常是文獻(xiàn)報(bào)道中的主要不良事件[5]。ALT和 AST主要存在于線粒體和細(xì)胞核內(nèi)， 它們參與體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用，能夠反映蛋白質(zhì)合成和分解代謝的狀況，進(jìn)而反映肝功能的狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞及線粒體受損時(shí)，ALT和 AST釋放入血，使其在血液濃度升高，活性就相應(yīng)升高。因此，血ALT和 AST的升高表明肝功能受損[13]。本研究結(jié)果顯示，只有高劑量組小鼠血清中AST高于對(duì)照組(P<0.05)，其他劑量組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而各劑量組血清中ALT值與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AST升高考慮可能與NBP濃度過(guò)高有關(guān)。表明在合理范圍內(nèi)應(yīng)用NBP不會(huì)引起小鼠肝臟功能的損傷。

BUN和SCr是反映腎功能的重要指標(biāo)[14-15]。檢測(cè)血液中BUN和SCr值可觀察腎臟功能的改變。本研究結(jié)果顯示各劑量組BUN和SCr與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 表明長(zhǎng)期應(yīng)用NBP對(duì)小鼠腎臟沒(méi)有毒性作用；此外，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)各臟器亦無(wú)異常變化，提示NBP無(wú)明顯不良反應(yīng)，服用安全。

綜上所述， 急性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在合理范圍內(nèi)NBP無(wú)急性不良反應(yīng)或毒性較低，并且不會(huì)對(duì)受試小鼠產(chǎn)生慢性毒性作用，長(zhǎng)期使用是安全的。

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(本文編輯：劉斯靜)

Studies on the acute and chronic toxicity test of dl-3-n-butylphthalide in mice

TIAN Xiao-chao1, HE Wei-liang2, LIU Si-wen3, Yang Rong1, LIU Su-yun1*

(1.Department of Cardiology， the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 2.Department of Neurology， Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China; 3.Department of Novelty Search，Hebei Medical Science and Information Research Institute, Shijiazhuang 050071, China)

Objective To explore the acute toxicity and chronic toxicity of dl-3-n-butylphthalide(NBP) in mice. Methods The Bliss method was used to observe the acute toxic symptoms and to obtain the toxic parameters medial lethal dose(LD50) of NBP in mice. Repeated administration of tail vein for 30 days, and the long-term toxicity to mice was observed. NBP is divided into low, medium and high dose group(40, 80 and 160 mg/kg respectvely), normal saline was used as control group. The changes of the blood chemistry(alanine transaminase, aspartate aminotransferase, blood urea nitrogen, serum creatinine), and histopathology were examined. Results The LD50 value of the NBP was 545.1 mg/kg. The elevating tendency of the levels of aspartate aminotransferase was observed in the high dose group of NBP. No significant changes were observed in clinical signs, other blood chemistry, and histopathology. Conclusion The rational use of NBP will not have adverse effects on the target animal.

toxicity tests; dl-3-n-butylphthalide; mice

2015-12-28；

2016-05-30

河北省食品藥品監(jiān)督局科技項(xiàng)目計(jì)劃(QN2015019)

田小超(1986-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事心血管疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:sxf67@sohu.com

R114

A

1007-3205(2016)11-1250-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.11.003