劉 源，唐 斌，張孝琴，楊 剛（西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院化學教研室，四川瀘州 646000）

大高良姜不同部位總黃酮的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究Δ

劉 源＊，唐 斌，張孝琴，楊 剛（西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院化學教研室，四川瀘州 646000）

目的：優(yōu)化大高良姜根、莖、葉不同部位總黃酮提取工藝并比較其體外抗氧化活性。方法：采用超聲輔助提取的方法，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken響應面試驗，以料液比、乙醇體積分數(shù)、水浴溫度、超聲時間為因素，以總黃酮提取率為指標，優(yōu)化大高良姜總黃酮提取工藝，并對各部位總黃酮在不同質(zhì)量濃度下（0.1～1.0 mg/ml）進行DPPH自由基清除、O2－自由基清除、植物和動物油脂保護作用的體外抗氧化活性試驗[均以維生素C（VC）為對照]。結果：最優(yōu)提取工藝為料液比1∶23.8、乙醇體積分數(shù)60%、水浴溫度80℃、超聲時間33.5 min；此條件下大高良姜根、莖、葉中總黃酮提取率分別為53.5、52.7、52.5 mg/g，與預測值相對誤差均不高于2.48%。各部位總黃酮在0.5 mg/ml時對DPPH自由基清除率為葉（94.3%）＞根（93.6%）＞莖（90.8%），VC為96.4%；在1.0 mg/ml時對O2－自由基清除率為根（63.7%）＞莖（60.2%）＞葉（42.9%），VC為94.7%；在0.4 mg/ml時對植物油脂的保護率為葉（39.7%）＞莖（30.6%）＞根（28.3%），對動物油脂的保護率為葉（40.6%）＞莖（30.2%）＞根（29.3%），VC均約為60%。結論：優(yōu)化的提取工藝可行，可用于大高良姜不同部位總黃酮的提?。桓鞑课豢傸S酮均具有一定的抗氧化活性，并以葉中總黃酮的抗氧化活性相對較強。

大高良姜；根；莖；葉；總黃酮；提取工藝；Box-Behnken響應面法；抗氧化活性

瀘州當?shù)氐奶厣〕渣S粑具有健脾暖胃、久置不腐的特點[1]，這與其包裹食物所用的大高良姜葉有關。四川境內(nèi)的大高良姜葉的種類很多，但僅在川南瀘州獨特的地理和氣候下生長的大高良姜葉才不長蟲、不“生病”、種植時也無需農(nóng)藥[2]，故其藥用價值值得探究。

大高良姜（Alpinia galangal Willd）為姜科山姜屬植物，是《中國藥典》收錄的藥用植物[3]，果實入藥稱為紅豆蔻。其味辛，性熱，有溫胃、散寒、行氣止痛之功效[4-5]，通常用作調(diào)經(jīng)劑、驅(qū)風劑、退熱劑和抗炎藥等，尤其對支氣管炎、心臟疾病、慢性腸炎、腎結石、糖尿病、風濕病及腎臟等多種中老年疾病有很好的防治效果[6]。黃酮類成分是大高良姜的藥效基礎。近年來對大高良姜的研究主要集中在根、莖部位[7]，但對其根、莖、葉等不同部位黃酮類含量及活性的比較研究鮮有報道。超聲提取技術是一種可加速植物細胞內(nèi)有效成分溶出而強化提取過程的技術，目前已越來越廣泛地應用于天然產(chǎn)物的提取工藝中[8]。筆者以瀘州當?shù)卮蟾吡冀母⑶o、葉為研究對象，采用超聲技術有效提取其中的總黃酮，并對各部位總黃酮的抗氧化活性進行研究，旨在為大高良姜的有效利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200型超聲波處理機（昆山市超聲儀器有限公司）；SP-1901型紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

大高良姜（2014年3月采挖于四川省瀘州市龍馬潭區(qū)特興鎮(zhèn)魏園村黃金山生態(tài)園，經(jīng)西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院唐斌教授鑒定為正品）；蘆丁對照品（上海阿拉丁化學試劑公司，批號：A2010Q37，純度：≥98%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司，批號：BC515795，純度：99%）；維生素C（VC，東北制藥集團有限公司，批號：20130412，純度：＞99.7%）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、鹽酸、乙醚等均為分析純；動物油為市購豬板油熬制而成；植物油為魯花菜籽油。

2 方法與結果

2.1 藥材的處理

將大高良姜整株洗凈后將其分成整株、根、莖、葉4個部分，置于40℃烘箱中烘干，粉碎，乙醚脫脂3次，過60目篩備用。

2.2 蘆丁的含量測定[9]

2.2.1 線性關系考察 精確稱取蘆丁對照品適量，溶于60%乙醇溶液并制備成0.20 mg/ml的對照品溶液。分別吸取上述溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，置于6個50 ml的量瓶中，加60%乙醇補至10.0 ml，再加5%NaNO2溶液0.80 ml，搖勻，靜置6 min；加10%Al（NO3）3溶液0.80 ml，搖勻，靜置6 min；加4% NaOH溶液5.00 ml，再用60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min。取不同質(zhì)量濃度（c）溶液于510 nm波長處測吸光度（A），繪制蘆丁標準曲線，得回歸方程：A＝8.398c+0.003（R2＝0.998 2），得蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10～200 μg/ ml。

2.2.2 方法學考察 根據(jù)相關要求進行方法學考察。結果，精密度試驗中吸光度的RSD＝1.03%（n＝6），表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗中含量的RSD＝0.98%（n＝6），樣品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；準確度試驗中平均方法回收率為99.05%（RSD＝1.26%，n＝6），表明該方法的準確度較好。

2.3 大高良姜中總黃酮的提取工藝及提取率測定[10]

準確稱取大高良姜粉2.00 g，加入一定體積分數(shù)的乙醇水浴加熱，超聲輔助提取（功率200 W），抽濾，石油醚萃?。壢ナ兔褜樱?，重復萃取2次。將2次濾液合并，加入乙醇定容至25 ml，搖勻，放置過夜。取1 ml置于50 ml量瓶中，按“2.2.1”項下方法于510 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線求出質(zhì)量濃度，并計算大高良姜總黃酮的提取率（提取液中總黃酮量/大高良姜粉量，mg/g）。

2.4 單因素試驗篩選各因素水平

以大高良姜整株粉為原料，設定超聲功率為200 W，乙醇

體積分數(shù)為80%，料液比為1∶25，水浴溫度為80℃，超聲時間為30 min。固定其他條件，依次改變料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）、乙醇體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、水浴溫度（40、50、60、70、80℃）、超聲時間（20、30、40、50、60 min），以總黃酮的提取率為評價指標，采用單因素試驗篩選各因素水平。每組試驗重復3次，取其平均值。結果如下：（1）隨著料液比的增加，總黃酮提取率增大；當料液比大于1∶30時，總黃酮提取率增加緩慢，至1∶35后逐漸趨于穩(wěn)定，這可能是由于黃酮溶出量已達到平衡所致。故以料液比為1∶30時較優(yōu)。（2）在乙醇低于70%時，隨著體積分數(shù)的升高，總黃酮提取率增加較為明顯；但高于70%后，總黃酮提取率隨之降低，原因可能是隨著乙醇體積分數(shù)升高，黃酮類化合物擴散速度加快，但當乙醇體積分數(shù)過高時，脂溶性的雜質(zhì)溶出增加并消耗溶劑所致。故以乙醇體積分數(shù)為70%時較優(yōu)。（3）總黃酮提取率隨著水浴溫度升高而增加，在60～70℃范圍內(nèi)提取率增幅變緩，而后明顯下降，原因可能是溫度升高導致脂溶性雜質(zhì)的溶出增加、消耗溶劑所致。故以水浴溫度為70℃時較優(yōu)。（4）隨著超聲時間的延長，總黃酮提取率增加明顯，但50 min后提取率逐漸下降，可能是黃酮的溶出率達到了動態(tài)平衡且黃酮氧化分解速度逐漸增加所致?？紤]到時間延長耗能增加，故以超聲時間為40 min時較優(yōu)。

2.5 Box-Behnken響應面試驗優(yōu)化各因素水平

2.5.1 試驗設計與方案 在單因素試驗基礎上，確定Box-Behnken響應面設計的自變量。以總黃酮的提取率為響應值（Y），設計4因素3水平中心組合試驗方案，對提取工藝進行優(yōu)化。試驗因素水平編碼設計見表1；響應面試驗設計方案及結果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

2.5.2 回歸分析與方差分析 根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合分析，得到模型的擬 合曲線方程為：Y＝49.62+1.71X1－0.31X2+1.93X3+1.86X4+0.30X1X2+ 0.050X1X3－0.13X1X4+2.73X2X3+1.60X2X4+2.00X3X4－3.27X12－1.10X22－3.25X32－1.52X42（R2＝0.992 6）。同時對模型進行了回歸系數(shù)和方差分析的顯著性檢驗，結果見表3。

由方差分析可知，該模型的P＝0.002 8＜0.01，表明該模型的回歸方程極為顯著。X3、X4因素對總黃酮提取率有顯著影響，各因素對總黃酮提取率影響大小順序為X3＞X4＞X1＞X2。其中，作用顯著的是X1、X2X3，極顯著的是X3、X4、X12、X32。

2.5.3 響應面分析各因素之間的交互作用 根據(jù)擬合回歸方程，固定4個因素中的任意2個因素為零水平，繪制另外2個交互項的響應面圖，以考察其對總黃酮提取率的影響，見圖1。

由圖1可見，X1與X3兩因素影響最大，而X2與X4影響不顯著。這與方差分析結果相一致。

2.5.4 最優(yōu)提取工藝的確定 利用Design-Expert 8.0.6軟件，得到最優(yōu)化的提取工藝為料液比1∶23.81、乙醇體積分數(shù)60.07%、水浴溫度79.63℃、超聲時間33.65 min。在此條件下總黃酮提取率的預測值為53.838 mg/g。綜合考慮總黃酮提取率和試驗可操作性等因素，調(diào)整最優(yōu)工藝條件為料液比1∶23.8、乙醇體積分數(shù)60%、水浴溫度80℃、超聲時間33.5 min。

表2 試驗設計方案與結果Tab 2 Design proposal and results of experiment

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

2.6 大高良姜根、莖、葉不同部位總黃酮提取驗證試驗

在上述最優(yōu)提取工藝條件下，分別對大高良姜不同部位（根、莖、葉）進行總黃酮的提取、測定，各試驗重復3次，結果見表4。

圖1 兩因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應面圖Fig 1 Response surface of the extraction rate of total flavonoids effected by two factors interaction

表4 大高良姜不同部位的總黃酮提取率Tab 4 The extraction rate of total flavonoids from different parts ofA.galangal

由表4可見，實測值與預測值間的相對誤差極小，說明建立的模型可信度較高、預測性良好，提取工藝可行，可用于大高良姜中總黃酮的提取。

2.7 大高良姜各部位總黃酮的體外抗氧化活性考察[11-12]

2.7.1 DPPH自由基清除率測定 將不同部位的總黃酮提取物用95%乙醇制備成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的總黃酮乙醇溶液，另同法制備VC溶液（作為陽性對照），分別取2.0 ml，各分別加入2.0 ml DPPH（1 mmol/L）溶液，混合均勻后于25℃避光反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度A1；另取2.0 ml各不同質(zhì)量濃度總黃酮乙醇溶液（VC溶液），加入2.0 ml 95%乙醇混合均勻后測定吸光度A2；測定2.0 ml水加入2.0 ml DPPH（1 mmol/L）溶液后的吸光度A0。計算DPPH自由基清除率：[1－（A1－A2）/A0×100%]。大高良姜不同部位總黃酮對DPPH自由基的清除率測定結果見圖2A。

由圖2A可見，大高良姜不同部位總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，在0.1～0.5 mg/ml范圍內(nèi)，從葉中提取的總黃酮在各質(zhì)量濃度下對DPPH自由基的清除率均高于根和莖；在質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml時，根、莖、葉提取的總黃酮及VC對DPPH自由基清除率分別為93.6%、90.8%、94.3%、96.4%，排序為VC＞葉＞根＞莖，但差別不大。

圖2 大高良姜不同部位總黃酮的體外抗氧化活性注：與VC比較，＊P＞0.05Fig 2 Antioxidant activity of total flavonoids from different parts ofA.galangal in vitroNote：vs.VC，＊P＞0.05

2.7.2 O2－自由基清除率測定 取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）4.0 ml，置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入1 ml不同部位的0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml總黃酮乙醇溶液和VC溶液（作為陽性對照），再加入1 ml 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入1 ml 8%HCl終止反應，于320 nm波長處測定吸光度A；空白對照組以相同體積蒸餾水取代總黃酮乙醇溶液，測定吸光度A0。計算O2－自由基清除率：（A0－A）/A0×100%。大高良姜不同部位總黃酮對O2－自由基的清除率測定結果見圖2B。

由圖2B可見，在0.1～1.0 mg/ml范圍內(nèi)，隨總黃酮質(zhì)量濃度增大清除率增大，但各部位總黃酮對O2－自由基的清除率明顯低于VC，根與莖的清除率非常接近，略高于葉；當質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml時，根、莖、葉、VC對O2－自由基的清除率分別為63.7%、60.2%、42.9%、94.7%，排序為VC＞根＞莖＞葉。

2.7.3 油脂保護率測定 取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml的各部位總黃酮乙醇溶液及VC溶液，加至溫熱油脂中，攪勻；在一定溫度的烘箱中強化保存，并以未加抗氧化劑者為對照組，于不同時間取樣，按GB/T5009.37-1996[12]測定油脂過氧化值（POV），再計算保護率。結果，大高良姜不同部位總黃酮對植物和動物油脂的保護率分別見圖2C、D。

由圖2C可見，在0.1～0.6 mg/ml范圍內(nèi)，隨總黃酮質(zhì)量濃度增大其對植物油脂的保護率增大。當總黃酮質(zhì)量濃度小于0.2 mg/ml時，各部位總黃酮對植物油脂的保護率與VC相似；在0.4 mg/ml時，對植物油脂的保護率大小為葉（39.7%）＞莖（30.6%）＞根（28.3%），VC約為60%；當質(zhì)量濃度在0.3～0.5 mg/ml范圍內(nèi)，對植物油脂的保護率大小順序為葉＞莖＞根；質(zhì)量濃度高于0.5 mg/ml時，則葉＞根＞莖。但總體來說，大高良姜根、莖、葉部位提取的總黃酮對植物油脂的保護率均低于VC。

由圖2D可見，當總黃酮質(zhì)量濃度小于0.3 mg/ml時，對動物油脂的保護率大小順序為根＞莖＞葉；質(zhì)量濃度高于0.4 mg/ml時，則葉＞莖＞根。在0.4 mg/ml時，對動物油脂的保護率大小為葉（40.6%）＞莖（30.2%）＞根（29.3%），VC約為60%?？傮w來說，當質(zhì)量濃度在0.1 mg/ml時，不同部位對動物油脂的保護率與VC相當；當質(zhì)量濃度在0.5 mg/ml時，葉提取物對動物油脂的保護率最大，且與VC相當。

3 討論

通過比較大高良姜不同部位總黃酮的提取率及體外抗氧化作用，結果表明，雖然葉中總黃酮的提取率與其他部位比較不是最高，但綜合來看，葉中的總黃酮在各不同的抗氧化性試驗中其抗氧化活性是相對較強的。比如當其質(zhì)量濃度達到0.5 mg/ml時，對動物油脂的抗氧化活性與VC相當。故此結論為瀘州黃粑用其葉包裹能久置不腐提供了科學依據(jù)，此結論也對綜合開發(fā)利用川南瀘州獨特的大高良姜及大高良姜葉提供了一定的實踐指導意義。

為更全面地分析大高良姜及大高良姜葉活性成分，筆者在此試驗的基礎上，下一步還將對提取工藝中的其他可能有影響的相關因素如超聲功率和提取次數(shù)等進行研究，并將針對大高良姜葉采用其他提取方法如酶解法、微波法來進行總黃酮的提取研究，將多種方法進行比較以選擇最優(yōu)方案，從而更好地開發(fā)利用大高良姜葉。

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Optimization of the Extraction Technology and Antioxidant Activity Study in vitro of Total Flavones from Different Parts of Alpinia galangal

LIU Yuan，TANG Bin，ZHANG Xiaoqin，YANG Gang（Dept.of Chemistry，College of Basic Medicine，Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of total flavonoids from the root，stem and leaves of Alpinia galangal and compare the antioxidant activities of the flavonoids in vitro.METHODS：Taking into account the four factors，such as the ratio of solid to liquid，the volume fraction of ethanol，the temperature of enzymatic hydrolysis and the time of ultrasonic，using the extraction rate of total flavonoids as index，with the method of ultrasonic assisted，the extraction technology of total flavonoids from A.galangal was optimized by Box-Behnken response surface test on the basis of single factor experiment.The antioxidant activity tests in vitro of different concentrations of total flavonoids（0.1-1.0 mg/ml）from different parts of A.galangal were conducted，including DPPH free radical clearance test，O2－free radical clearance test，protective test of vegetable and animal fat [using vitamin C（VC）as control].RESULTS：The optimal extraction technology as follows as the ratio of solid to liquid was 1∶23.8；the volume fraction of ethanol was 60%；water bath temperature was 80℃；ultrasonic time was 33.5 min.Under this condition，the extraction rates of total flavonoids from the root，stem and leaves of A.galangal were 53.5，52.7，52.5 mg/g.The rates of their relative error from predicted value were all no more than 2.48%.When the mass concentration was 0.5 mg/ml，the antioxidant capacity of total flavonoids from different parts of A.galangal to DPPH free radicals was as follows as leaves（94.3%）＞root（93.6%）＞stem（90.8%）；the antioxidant capacity of VC was 96.4%.When the mass concentration was 1.0 mg/ml，the antioxidant capacity to O2－free radicals was as follows as root（63.7%）＞stem（60.2%）＞leaves（42.9%）；the antioxidant capacity of VC was 94.7%.When the mass concentration was 0.4 mg/ml，the protective rate to vegetable fat was as follows as leaves（39.7%）＞stem（30.6%）＞root（28.3%）；the protective rate to animal fat was as follows as leaves（40.6%）＞stem（30.2%）＞root（29.3%）；the protective rate of VC was about 60%.CONCLUSIONS：Optimized extraction technology is feasible，and can be used for the extraction of total flavones from different parts of A.galangal.Total flavones from different parts have certain antioxidant activity，specially the total flavones from leaves of A.galangal is stronger than other.

Alpinia galangal；Root；Stem；Leaves；Total flavones；Extraction technology；Box-Behnken response surface methodology；Antioxidant activity

R284.1；R285.5

A

1001-0408（2016）31-4429-04

2016-01-05

2016-03-21）

（編輯：劉 萍）

2014年瀘州市科技局項目[No.2014（56）]；2015年西南醫(yī)科大學科研基金（No.LZ20150026）

＊講師，碩士。研究方向：化學教學與科研。電話：0830-2525695。E-mail：190670328@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.32